c-Abl调节可变剪接及无义突变介导的mRNA降解

论文摘要

c-abl是Abelson鼠白血病病毒原癌基因v-abl在细胞内的同源物,广泛表达于哺乳动物细胞中[1]。其编码产物c-Abl属于非受体酪氨酸激酶家族（non-receptor tyrosine kinase family）,具有多个功能结构域,如SH3、SH2、ATP结合区、激酶活性区（TK）、富含脯氨酸区、核定位信号区（NLS）、DNA结合区、G-Actin及F-Actin结合区、核输出信号区（NES）等。DNA损伤反应如离子辐射、顺铂等通过ATM或DNA-PK途径激活细胞核中的c-Abl,诱导细胞周期停滞。在紫外线和TNF-α诱导的应激损伤反应中,c-Abl通过与IκBα的相互作用诱导细胞凋亡。Abelson超家族还包括另一个成员,Abl相关基因Arg（abelson related gene）。Arg和c-Abl高度同源。前期研究显示,c-Abl能够与某种剪接因子相互作用,提示c-Abl可能参与调控细胞中的可变剪接过程。真核生物前体RNA除去内含子连接外显子获得成熟mRNA的过程称为剪接（splicing）。在剪接过程中通过选择不同的剪接位点而产生不同的mRNA异构体,即可变剪接（alternative splicing,AS）。可变剪接是由一种称为剪接体的复合物执行的,该复合物由五种snRNPs（U1,U2,U4,U5,U6）和大量的辅助蛋白组成,通过多种信号精确识别剪接位点完成剪接过程。可变剪接是基因调控和蛋白质多样性的重要机制,受到多种顺式元件和反式因子的调节。AS可以产生新的蛋白质,改变蛋白质的结合特性,酶活性,细胞内定位,信号传导功能以及稳定性等。异常的AS可能导致相关疾病的发生。AS可以使mRNA的阅读框发生改变,产生提前终止密码子（premature temination codons,PTC）。含有PTC的mRNA可以通过NMD（nonsense-mediated mRNA decay）途径得到降解。NMD也是调节基因表达水平的方式,可以作为一种监督机制,使含有PTC的mRNA在翻译成功能缺失的截短蛋白而可能对细胞造成毒害之前就被清除掉,避免对细胞造成损害。通过RNA干扰获得c-Abl敲低（knockdwon,KD）的人乳腺癌成纤维细胞系MCF-7稳定突变株,将培养细胞提取总RNA,应用Affymetrix外显子芯片检测突变株和野生型细胞中全基因组的剪接变化。经过一定的数据处理步骤,筛选若干重要的基因用RT-PCR方法进行验证,获得了发生可变剪接的基因,初步证实c-Abl对可变剪接的调控作用。对发生可变剪接的基因做了初步的功能探讨,并分析了其可变剪接与c-Abl之间的关系。在受调控的基因中,发现了3个基因新的可变剪接异构体,其中IL4R、PSMB10以及SRRM1/SRm160通过可变剪接使阅读框发生移码而产生提前终止密码子（premature termination codon,PTC）。IL4R缺失第六个外显子（Ex6）,PSMB10和SRRM1/SRm160则分别在Ex6和Ex7、Ex3和Ex4之间发生内含子保留（intron retention）,从而使原来的编码框发生改变,出现提前终止。在人类细胞KD/MCF-7和小鼠DKO（abl和arg双敲除）/MEF中检测各基因PTC剪接异构体的表达,结果显示,在人源细胞MCF-7中,c-Abl的敲低（KD）使SRRM1、PSMB10和IL4R的"PTC+mRNA"相对升高;在小鼠同源基因中,SRRM1和PSMB10的"PTC+mRNA"在c-Abl和Arg双敲除的条件下有较明显的上调,IL4R则没有检测到对应的"PTC+mRNA"。说明这些基因的"PTC+mRNA"的剪接与c-Abl是相关的。RNA干扰和蛋白质抑制方法证实,SRRM1/SRm160的"PTC+mRNA"通过NMD机制被降解。进一步研究发现,该"PTC+mRNA"在293细胞中具有细胞周期特异性,G1期表达量最高,而在S期及G2/M期较低。我们还分析了21个已经被证实可以通过NMD降解含PTC剪接异构体的小鼠基因,然后在DKO/MEF细胞中进行验证。结果显示,相对于野生型MEF,在c-Abl和Arg双敲除的DKO细胞中,多达10个基因含有PTC的剪接异构体表达量都有显著的上升,说明c-Abl参与调节基因"PTC+mRNA"的剪接过程,甚至参与调控NMD过程,进一步证明了c-Abl对可变剪接的调节作用。

论文目录

• 缩略词表
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1. c-Abl
• 2. 可变剪接
• 3. 无义突变介导的mRNA 降解（NMD）
• 4. 外显子芯片
• 4.1 外显子芯片探针的设计
• 4.2 外显子芯片操作流程
• 4.3 外显子芯片数据分析
• 5. 研究目的、思路及意义
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 细胞株、菌株及质粒
• 1.2. 分子生物学工具酶及试剂盒
• 1.3.细胞培养用品
• 1.4 Western-blot 试剂
• 1.5 主要仪器
• 1.6 其他
• 2 方法
• 2.1 细胞培养、冻存与转染
• 2.2.RNA 提取与 RT-PCR
• 2.3 甲醛变性胶及相关溶液的配制
• 2.4 pSR-GFP/Neo-UPF1-siRNA 载体的构建
• 2.5 RNA 干扰与Western 印迹
• 2.6 蛋白质浓度的测定
• 2.7 细胞周期同步化（G1 阻滞）
• 2.8 流式细胞术测细胞周期
• 结果
• 1. c-Abl 调节可变剪接
• 1.1 外显子芯片检测可变剪接
• 1.2 RT-PCR 验证可变剪接及分析
• 2. c-Abl 调节"PTC+mRNA"的剪接
• 2.1 新的剪接异构体形成PTC
• 2.2 c-Abl 调节"PTC+mRNA" 的剪接
• 2.3. SRRM1/SRm160 含 PTC 的剪接异构体触发无义突变介导的 mRNA 降解
• 2.4 SRRM1/SRm160 "PTC+mRNA"的表达具有细胞周期特异性
• 3. c-Abl 广泛调节无义突变介导的mRNA 降解（NMD）
• 讨论
• 1. c-Abl 调节可变剪接
• 2. c-Abl 调节无义突变介导的mRNA 降解
• 结论
• 参考文献
• 附录一 RT-PCR 引物
• 附录二 外显子芯片数据
• 文献综述
• 发表论文
• 个人简历
• 致谢