应用噬菌体随机肽库技术研究干扰素-α2b的模拟肽和拮抗肽

论文摘要

干扰素（interferon,IFN）是一类重要的细胞因子,作为抗病毒和抗肿瘤的药物已广泛用于临床。IFN通过与靶细胞表面的受体结合后,激活信号通路,诱导相关抗病毒、抗肿瘤基因的转录和表达,发挥其生物学作用。而蛋白质之间的相互作用或识别是通过局部肽段间的少量氨基酸残基相互作用来实现的,合理设计的小肽可以完全或部分模拟完整蛋白分子的功能。通常完整的蛋白分子由于对蛋白酶敏感、具有宿主免疫原性以及成本高等原因并不是最佳的候选药物。IFN除了具有以上不足外,在临床使用时还会出现副作用,限制了其使用。而小分子肽类细胞因子模拟物或拮抗剂由于其相对分子质量小、易于合成、无抗原性和毒副作用较小等特点,在基础研究以及临床治疗等领域逐渐显现出其优势。本论文以IFN-α2b为研究对象,以Anti-IFN-α2b多克隆抗体、天然表达IFN受体的细胞为靶标,利用噬菌体随机肽库技术,研究IFN-α2b的抗原表位、筛选IFN-α2b的拮抗肽和模拟肽,对研究IFN的分子机制以及设计和开发IFN小分子模拟肽药物有重要的意义。本文首先以结合有Anti-IFN-α2b多克隆抗体的免疫磁性微球为靶标,筛选噬菌体随机12肽库。经ELISA鉴定,四轮筛选后同抗体结合的噬菌体得到明显的富集,其阳性率达到53%（49/92）。随机挑取12个阳性噬菌体进行序列分析并与IFN-α2b序列进行同源比对。结果显示:12个阳性克隆可分为三组,分别对应IFN-α2b N端（1～13）、AB环附近（35～47）和CD环附近（98～110）的三组高抗原性表位区,与IFN抗原预测分析的数据相吻合。特异性抗体封闭试验和噬菌体免疫试验表明,所得到的噬菌体展示肽在免疫反应性和免疫原性上均可以一定程度地模拟IFN-α2b不同的表位区。结合IFN的三维结构进行分析,三组模拟表位均暴露在IFN分子结构的外部,更容易被抗原呈递细胞上的抗原识别受体所识别。其中第二组表位AB环（29～35）直接参与与IFN受体的结合,推测在使用IFN治疗疾病过程中,针对该区域所产生的中和抗体可能直接影响IFN的生物学活性。采用基因重组技术,本文成功构建了原核表达载体pET32a（+）/GFP- IFN -α2b,并在大肠杆菌E.coli BL21中成功地进行了表达。SDS-PAGE和Western blot实验显示该融合蛋白GFP-IFN-α2b保持了良好的IFN抗原性;受体结合实验表明,该融合蛋白能够与WISH细胞上的IFN受体结合,并在488nm激发光下呈现亮绿色荧光;抗病毒实验表明,该融合蛋白具有一定的抗病毒活性,比活力为1.0×107IU/mg,证明该融合蛋白为具有绿色荧光和IFN抗病毒活性的双功能蛋白。本研究为在细胞及分子水平研究IFN与靶细胞相互作用提供了简便、快捷、直观的研究材料,同时也为IFN的代谢及功能研究建立了方法学基础。以天然表达IFN受体的WISH细胞并结合Anti-IFN-α2b多克隆抗体为靶分子,本文采用竞争性洗脱的方法筛选噬菌体随机7肽库。经鉴定六轮筛选后同细胞和抗体结合的噬菌体得到明显的富集,最后一轮筛选的阳性率达到51.1%（23/45）。随机挑取10个阳性克隆进行序列分析并与IFN序列进行同源比对。结果显示:10个克隆可分为三组,分别对应IFN AB环的24～41和43～49以及E螺旋的148～158位氨基酸残基。分别选取对应AB环的第一组的No.26,以及E螺旋第三组的No.35两个噬菌体克隆为例做进一步研究。竞争性ELISA和细胞免疫组化实验显示,No.26和No.35能与IFN竞争性的同IFN受体或抗体结合。以其展示的序列分别合成SP-7（SLSPGLP）和FY-7（FSAPVRY）两个小肽。细胞受体竞争实验显示,SP-7和FY-7能够有效地模拟IFN的部分受体结合表位,特异性地抑制IFN与其受体的结合,其IC50值分别为8.90μg和3.22μg。采用细胞病变抑制法分析SP-7和FY-7对IFN抗病毒活性的影响,结果显示当两个合成肽的加入量在6.25～100μg之间时,合成肽对IFN抗病毒活性均具有抑制作用,并且存在剂量依赖关系,其IC50约为25μg,证明SP-7和FY-7为两个IFN拮抗肽。为了得到具有抗病毒活性的IFN模拟肽,本文在上述细胞筛选的基础上,对上述同细胞结合的噬菌体,又增加了三轮功能筛选。经鉴定具有抗病毒活性的噬菌体克隆得到了一定的富集,其阳性率为1.98%（20/1012）。随机挑取10个阳性克隆进行序列分析并与IFN-α2b的序列进行比对。结果显示:10个克隆可分为四组,分别对应IFN的31～37、68～74、93～121和132～161位氨基酸残基。其中第一组的No.T9（31～37）与IFN中AB环（26～35）有部分重叠;第四组中的No.T3（143～149）与IFN中E螺旋（141～158）有部分重叠,并且其序列中144R和149R与IFN分子中参与受体结合并激活信号通路的“热点”氨基酸一致。竞争ELISA和细胞免疫组化实验显示,No.T9和No.T3能与IFN竞争性的同IFN受体结合。以其展示的序列分别合成KP-7（KNVHPPP）和IR-7（IRPDTPR）两个小肽。细胞受体竞争实验显示,KP-7和IR-7能有效地模拟IFN的部分受体结合表位,特异性地抑制IFN与其受体的结合,其IC50值分别为13.43μg和9.49μg。细胞病变抑制法的抗病毒实验表明:KP-7和IR-7在1.25～5μg范围内,表现出一定的抗病毒活性,并呈现剂量依赖关系,证明KP-7和IR-7为两个模拟IFN不同表位具有抗病毒作用的模拟肽。其中KP-7抗病毒活性略高于IR-7,并在发挥抗病毒作用时两者呈现出一定的协同作用,提示IFN的抗病毒作用是多位点共同作用其受体的结果。本文较全面地了解了IFN-α2b的抗原结合价,以及其特定的抗原决定簇的特性,为进一步探讨IFN分子与受体的作用机理,制备抗特定表位的单克隆抗体奠定了基础。同时本文开发了全细胞结合抗体或功能性筛选的淘筛系统,为细胞因子的拮抗肽和模拟肽的筛选,研究IFN的功能和分子机制,以及小肽类药物的开发提供了一条新的途径。

论文目录

摘要

Abstract

第一章引言

第一节干扰素及其研究进展

1.1.1 概况

1.1.2 I型干扰素分子结构

1.1.3 I型干扰素受体的研究进展

1.1.4 干扰素的信号传递

1.1.5 干扰素与受体作用的分子机理

1.1.6 干扰素的抗病毒机理

第二节噬菌体展示及随机肽库技术

1.2.1 噬菌体展示及其原理

1.2.2 随机肽库技术

1.2.3 随机肽库的应用

第三节小肽类药物的研究进展

1.3.1 小分子短肽模拟细胞因子的可行性

1.3.2 拮抗细胞因子活性的小分子短肽

1.3.3 模拟细胞因子活性的小分子短肽

第四节本论文的研究目的和意义

第二章应用噬菌体随机肽库技术筛选IFN-α2b抗原表位

第一节材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

2.1.2.1 抗IFN-α2b多克隆抗体的制备

2.1.2.2 Protein-G磁性微球捕获Anti-IFN多抗

2.1.2.3 随机12肽库的生物淘筛

2.1.2.4 噬菌体滴度的测定

2.1.2.5 噬菌体的扩增和纯化

2.1.2.6 单个噬菌斑的扩增

2.1.2.7 阳性噬菌体克隆的鉴定

2.1.2.8 噬菌体单链DNA的制备

2.1.2.9 DNA序列测定及同源性分析

2.1.2.10 噬菌体封闭抗体实验

2.1.2.11 噬菌体免疫实验

第二节结果

2.2.1 噬菌体随机12肽库的淘筛

2.2.2 阳性噬菌体克隆的鉴定

2.2.3 阳性噬菌体克隆的聚类分析

2.2.4 阳性噬菌体克隆的DNA序列测定及同源性分析

2.2.5 噬菌体封闭抗体实验

2.2.6 噬菌体抗体的免疫反应实验

第三节讨论与小结

第三章绿色荧光蛋白-干扰素α2b融合基因的构建与表达

第一节材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.1.2.1 GFP与IFN-α2b融合基因片段的获得及原核表达载体的构建

3.1.2.2 融合蛋白的诱导表达及纯化

3.1.2.3 SDS-PAGE鉴定

3.1.2.4 免疫印迹分析

3.1.2.5 WISH细胞的培养

3.1.2.6 融合蛋白与IFN受体的结合实验

3.1.2.7 VSV病毒的扩增

3.1.2.8 VSV病毒滴度的测定

3.1.2.9 融合蛋白抗病毒活性的测定

第二节结果

3.2.1 外周血淋巴细胞总RNA的提取

3.2.2 IFN基因的扩增、序列测定以及同源性比对

3.2.3 含有GFP-IFN-α2b融合基因重组质粒的鉴定

3.2.4 融合基因在大肠杆菌中的表达及分析

3.2.5 融合蛋白特征性荧光的检测

3.2.6 GFP-α2b- IFN 与 IFN 受体结合能力的考察

3.2.7 GFP-IFN-α2b抗病毒活性的测定

第三节讨论

第四章应用噬菌体随机肽库技术筛选 IFN-α2b 的拮抗肽

第一节材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验方法

4.1.2.1 WISH细胞的培养

4.1.2.2 活细胞筛选板的制备

4.1.2.3 细胞ELISA板的制备

4.1.2.4 细胞淘筛

4.1.2.5 Anti-IFN多抗淘筛

4.1.2.6 细胞固定方法考察

4.1.2.7 洗脱方法的考察

4.1.2.8 阳性噬菌体克隆的鉴定

4.1.2.9 阳性噬菌体克隆的竞争抑制实验

4.1.2.10 阳性噬菌体克隆的细胞免疫组化

4.1.2.11 阳性噬菌体克隆的DNA序列测定及同源性分析

4.1.2.12 竞争性细胞受体结合实验

4.1.2.13 合成肽对干扰素抗病毒活性的影响

第二节结果

4.2.1 细胞淘筛及富集效果分析

4.2.2 抗体淘筛及富集效果分析

4.2.3 阳性噬菌体克隆的鉴定

4.2.4 细胞免疫组化

4.2.5 阳性噬菌体克隆的聚类分析

4.2.6 阳性噬菌体DNA序列测定及同源性分析

4.2.7 七肽合成及分析

第三节讨论

第五章应用噬菌体随机肽库技术筛选 IFN-α2b 的模拟肽

第一节材料与方法

5.1.1 实验材料

5.1.2 实验方法

5.1.2.1 WISH细胞的培养

5.1.2.2 活细胞筛选板的制备

5.1.2.3 细胞ELISA板的制备

5.1.2.4 功能筛选

5.1.2.5 阳性噬菌体克隆的鉴定

5.1.2.6 阳性噬菌体克隆的DNA序列测定及同源性分析

5.1.2.7 细胞免疫组化

5.1.2.8 合成肽的竞争性受体结合实验

5.1.2.9 合成肽的抗病毒活性检测

第二节结果

5.2.1 功能筛选富集效果的分析

5.2.2 阳性噬菌体克隆的鉴定

5.2.3 阳性噬菌体DNA序列测定及同源性分析

5.2.4 细胞免疫组化

5.2.5 七肽合成及分析

第三节讨论

总结与展望

致谢

参考文献

附录

在学期间发表论文

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