胡杨DREB转录因子基因的克隆及其功能分析

论文摘要

通过转录因子在转录水平上调控目的基因的表达,是植物对其生长发育及生理代谢调控的一种重要方式。DREB转录因子基因家族的成员广泛存在于拟南芥、玉米、番茄、烟草和水稻等各种植物中,并参与调控各种功能基因的表达。本研究对从沙生植物胡杨中新克隆的PeDREB2a和PeDREB2b转录因子基因的基本特性及生物学功能进行了系统的研究,证明这两个基因具有DREB类转录因子基因的基本特性,它们在转基因烟草中的过表达可以提高植物抵抗非生物胁迫的能力。这些研究结果为深入了解这两个基因调控植物胁迫应答反应的分子机理提供了理论基础,也为利用基因工程的方法改良作物的抗逆性提供了优良的候选基因。主要研究结果如下:1.根据植物中DREB基因DNA结合域保守区设计简并引物,以沙生植物胡杨的叶片为材料,RT-PCR扩增出2个DREB基因同源片段;据此设计基因特异引物,通过RACE-PCR分离克隆出2个DREB转录因子基因,PeDREB2a（序列号:EF597499）和PeDREB2b（序列号:EU195881）,氨基酸序列比对表明,这2个基因为典型的DREB2转录因子基因。2.半定量RT-PCR对这2个基因在不同胁迫条件下的表达情况进行了检测,结果显示:这两个基因的表达均受干旱、高盐和低温环境逆境的诱导,并且其表达不依赖于ABA的调控。3.以基因组DNA为模板对PeDREB2a和PeDREB2b进行了PCR扩增,扩增产物经序列分析表明,PeDREB2a和PeDREB2b基因均无内含子。4.构建两个酵母效应质粒pBridge-PeDREB2a和pBridge-PeDREB2b,转入酵母菌株AH109中,并分别在缺少色氨酸的SD培养基和缺少色氨酸、组氨酸的SD双缺陷培养基上筛选阳性转化子。酵母表达表明,PeDREB2a和PeDREB2b均具有明显的转录激活功能,β-半乳糖苷酶活性分别为27.8U和23.75U,Whatman滤纸显色反应均能呈现明显的蓝色,初步在酵母体中通过酵母单杂交试验验证这两个转录因子具有转录激活功能。5.构建绿色荧光蛋白融合表达载体,基因枪法转化洋葱表皮细胞进行瞬时表达,结果表明,PeDREB2a和PeDREB2b蛋白均定位于细胞核中,与亚细胞定位预测一致。6.构建植物表达载体pCAMBIA2301-PeDREB2a和pCAMBIA2301-PeDREB2b,利用农杆菌介导法转化烟草NC89;通过Kan抗性、PCR及RT-PCR筛选鉴定阳性苗。对转基因烟草苗进行干旱、高盐等抗逆性分析并且对其相关生理生化指标进行测定,结果显示转基因烟草苗对这些非生物胁迫均有较高的抵抗能力。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 植物抗渗透胁迫的分子机制
• 1.1 植物抗渗透胁迫的信号转导与调控
• 1.1.1 依赖ABA 但不需要蛋白质合成的信号转导途径（Ⅰ）
• 1.1.2 依赖ABA 且需要蛋白质合成的信号转导途径（Ⅱ）
• 1.1.3 不依赖ABA 的信号转导途径（Ⅲ、Ⅳ）
• 1.2 抗渗透胁迫基因产物的种类
• 1.2.1 功能蛋白
• 1.2.2 调节蛋白
• 2 植物转录因子研究
• 2.1 植物转录因子的特征与种类
• 2.1.1 高等植物转录因子的功能结构域
• 2.1.2 转录因子的作用机制
• 2.1.3 转录因子的种类
• 2.2 植物转录因子的研究方法
• 2.2.1 植物转录因子基因的克隆
• 2.2.2 植物转录因子功能分析方法
• 3 植物AP2/EREBP 转录因子家族的研究进展
• 3.1 AP2/EREBP 转录因子家族的分类研究
• 3.2 AP2/EREBP 转录因子家族的起源和进化
• 3.3 AP2/EREBP 转录因子的功能
• 3.3.1 参与植物生长发育
• 3.3.2 参与生物胁迫应答
• 3.3.3 参与非生物胁迫应答
• 3.4 DREB 转录因子的研究进展
• 4 立题依据
• 4.1 目的意义
• 4.2 研究目标
• 4.3 主要研究内容
• 第二章 胡杨DREB 转录因子基因的克隆及特性分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料培养及胁迫处理
• 1.1.2 菌株
• 1.1.3 载体
• 1.1.4 酶与试剂
• 1.1.5 其它试剂
• 1.1.6 溶液
• 1.1.7 培养基
• 1.1.8 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 胡杨总RNA 的提取（热CTAB 法）
• 1.2.2 第一链cDNA 的合成
• 1.2.3 DREB 基因同源片段的克隆
• 1.2.4 胡杨DREB 基因的3`cDNA 的克隆
• 1.2.5 巢式PCR 扩增5`端cDNA
• 1.2.6 DREB 基因cDNA 全长扩增
• 1.2.7 DNA 序列的扩增及分析
• 1.2.8 DREB 基因在不同胁迫条件下的表达模式分析
• 2 结果与分析
• 2.1 DREB 基因同源片段的获得
• 2.2 DREB 基因cDNA3`序列和5`序列的获得
• 2.3 DREB 基因cDNA 全长序列的获得
• 2.4 胡杨DREB 基因的生物信息学分析
• 2.4.1 DREB 基因的序列特征分析及编码蛋白的结构功能预测
• 2.4.2 DREB 蛋白的三维空间结构预测
• 2.4.3 PeDREB2a和PeDREB2b蛋白与其它DREB2类蛋白的同源性比对及系统进化树分析
• 2.5 胡杨 DREB2a 和 DREB2b 基因的基因组 DNA 结构分析
• 2.6 DREB 基因在不同胁迫条件下的表达模式分析
• 3. 讨论
• 3.1 利用同源克隆的方法分离克隆胡杨 DREB 转录因子基因
• 3.2 PeDREB2a 和PeDREB2b 基因的全长序列分析
• 3.3 胡杨 DREB 转录因子基因在不同胁迫条件下的表达模式分析
• 第三章 胡杨PeDREB2a 和PeDREB2b 转录因子转录激活功能的验证
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 菌株与质粒
• 2.2 酵母培养基
• 2.3 酵母表达系统中使用的溶液及缓冲液
• 2.4 酵母表达
• 2.4.1 引物的设计与合成
• 2.4.2 在酵母中表达的效应质粒的构建
• 2.4.3 效应质粒的转化及菌落PCR 鉴定
• 2.4.4 效应质粒的小量提取（碱法）
• 2.4.5 效应质粒的酶切鉴定
• 2.4.6 酵母感受态细胞的制备及转化
• 2.4.7 β-半乳糖苷酶活性滤纸分析
• 2.4.8 β-半乳糖苷酶活性（β-Galactosidase activity）测定
• 3 结果与分析
• 3.1 在酵母中融合表达的重组质粒的构建
• 3.1.1 重组质粒pBD-PeDREB2a 和pBD-PeDREB2b 的构建
• 3.1.2 重组质粒的菌落PCR 鉴定
• 3.1.3 重组质粒的酶切鉴定
• 3.1.4 重组质粒的测序分析
• 3.2 重组质粒的酵母转化
• 3.3 转化酵母菌株的β-半乳糖苷酶活性检测
• 4 讨论
• 第四章 PeDREB2a 和 PeDREB2b 转录因子的亚细胞定位
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 载体与菌株
• 2.1.3 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物设计与合成
• 2.2.2 GFP 融合表达载体的构建
• 2.2.3 重组质粒的转化及菌落PCR 鉴定
• 2.2.4 重组质粒的小量提取（碱法）及酶切鉴定
• 2.2.5 基因枪法转化洋葱表皮细胞
• 3 结果与分析
• 3.1 与绿色荧光蛋白融合表达的重组质粒的构建
• 3.1.1 重组质粒p163-GFP-PeDREB2a 和p163-GFP-PeDREB2b 的构建
• 3.1.2 重组质粒的菌落PCR 鉴定
• 3.1.3 重组质粒的酶切鉴定
• 3.1.4 重组质粒的测序分析
• 3.2 重组质粒在洋葱表皮细胞中的瞬时表达
• 4. 讨论
• 第五章 植物高效表达载体的构建及胡杨PeDREB2a和PeDREB2b基因在烟草中的相关功能验证
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株及载体
• 2.1.3 实验中所用试剂与药品
• 2.1.4 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物设计与合成
• 2.2.2 植物表达载体的构建
• 2.2.3 烟草的遗传转化
• 2.2.4 转基因烟草的筛选
• 2.2.5 转基因烟草的耐胁迫分析
• 2.2.6 转基因烟草在逆境条件下的生理生化指标测定
• 3. 实验结果与分析
• 3.1 植物表达载体的构建
• 3.1.1 表达载体pCAMBIA2301-PeDREB2a 和 pCAMBIA2301-PeDREB2b 的构建
• 3.1.2 重组质粒的菌落PCR 鉴定
• 3.1.3 重组质粒的酶切鉴定
• 3.2 含有表达载体的农杆菌PCR 检测
• 3.3 转基因烟草的筛选和检测
• 3.3.1 转基因烟草的DNA 水平检测
• 3.3.2 转基因烟草的RT-PCR 检测
• 3.4 转基因烟草对非生物胁迫的耐受分析
• 3.4.1 转基因烟草的抗旱性分析
• 3.4.2 转基因烟草的耐盐性分析
• 3.5 转基因烟草在逆境条件下的生理生化指标测定
• 3.5.1 转基因烟草植株胞质总蛋白含量的测定
• 3.5.2 转基因烟草植株脯氨酸含量的测定
• 3.5.3 转基因烟草植株可溶性糖含量的测定
• 4. 讨论
• 第六章 主要结论及创新点
• 6.1 主要结论
• 6.2 创新点
• 参考文献
• 缩略词表
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介