mPRβ在猪卵母细胞体外成熟过程中的表达和作用的研究

论文摘要

孕激素膜受体（membrane progestin receptors,mPRs）,是最近发现的一个大的蛋白家族成员,包括α、β和γ三种亚型。以往研究显示,它们在低等脊椎动物卵母细胞成熟过程中起着重要的作用。但是,到现在为止,还没有它们在哺乳动物卵母细胞成熟过程中的表达和作用的相关研究。为了检测mPRβmRNA是否在猪卵母细胞—卵丘细胞复合体（oocyte-cumulus complexes,COCs）中表达,本实验利用GeneBank上猪mPRβ的cDNA序列设计引物,扩增出了一段1447bp序列,并将所得序列进行了测序和BLAST比对。结果显示,所测得的序列与GeneBank上cDNA序列的同一性为100%,说明mPRβmRNA在猪的COCs中有表达。随后,用半定量RT-PCR,分析了猪COCs体外成熟过程中,0h,12h,20h,36h和44h五个时期mPRβmRNA的表达情况。结果显示,20h和36h mPRβmRNA的表达量显著高于0h（P＜0.05）,其它各组间没有显著差异。在整个成熟过程中,mPRβmRNA的表达呈先升高后降低的趋势,并在20h达到峰值。为了研究促性腺激素对mPRβmRNA的表达是否有影响,将成熟培养液中的LH或FSH去除。结果显示,去除培养液中的LH或FSH,对mPRβmRNA的表达没有显著的影响。以上在转录水平上对mPRβ在猪COCs中的表达进行了分析。为了进一步在翻译水平上研究mPRβ在猪COCs中表达的规律,利用mPRβ的一段多肽制备了抗体,进行蛋白分析。Western blotting结果显示,在0h没有mPRβ表达,在20h有高的表达量,而在44h其表达量又降到很低水平。三个时期的表达量之间差异显著（P＜0.05）。免疫荧光分析显示,mPRβ至少部分定位在卵丘细胞的膜上。而在小鼠的胎儿成纤维细胞（mouse embryofibroblasts,MEFs）中,mPRβ主要定位于内质网上。在猪COCs的成熟培养液中添加10%的抗血清mPRβ抗体,可以明显地抑制卵丘细胞的扩展（P＜0.05）。最后,通过生物信息学分析发现,这个蛋白可能是通过胞吐参与了卵丘细胞扩展过程。总之,mPRβmRNA和蛋白都在猪COCs体外成熟过程中,呈特定的表达模式。其亚细胞定位具有组织特异性,并且该蛋白与卵丘细胞的扩展相关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 文献综述
• 第一章 孕激素膜受体的研究进展
• 1.1 经典的孕激素受体及其作用方式
• 1.2 孕激素的迅速的非基因组作用
• 1.3 曾经发现的多种的孕激素膜
• 1.4 孕激素膜受体（mPRs）的发现和研究进展
• 1.5 mPR研究中存在的问题与展望
• 第二部分 实验部分
• 第二章 mPRβ mRNA在猪卵母细胞卵丘细胞复合体中的表达的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.2 实验结果
• 2.3 讨论
• 2.4 结论
• 第三章 从蛋白水平检测mPRβ的表达和mPRβ在猪COCs体外成熟过程中的作用的初步研究
• 3.1.材料和方法
• 3.2 实验结果
• 3.3 讨论
• 3.4 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 发表论文情况