扇贝糖原硫酸酯的制备及生物活性研究

论文摘要

扇贝是一种重要的水产经济动物。本文以新鲜虾夷扇贝闭壳肌为原料,提取扇贝糖原,并对其结构进行鉴定,然后对扇贝糖原进行硫酸化修饰并优化其工艺条件,研究扇贝糖原硫酸酯的硫酸取代度及分子量对其生物活性的影响。本研究采用胃蛋白酶提取,木瓜蛋白酶和sevag法除蛋白得到扇贝糖原（scallop muscle glycogen, SMG）。 SMG的得率为13.78%,其中糖含量为91.91%,蛋白含量为1.08%,相对分子质量约为430 kDa,单糖组成仅为葡萄糖。甲基化结果表明,SMG链接组成中全部单糖为葡萄糖,所含键型中1,4链接占绝大多数,为糖原的典型组成特征。采用氯磺酸-吡啶法对所提取SMG进行硫酸酯化修饰获得扇贝糖原硫酸酯（sulfated scallop muscle glycogen, SSMG）,经红外光谱分析表明,硫酸基与扇贝糖原形成硫酸酯化合物。以硫酸取代度（degree of sulfatation, DS）为指标,对硫酸酯化试剂体积、反应温度以及反应时间进行优化。结果显示,最佳修饰条件为酯化试剂中氯磺酸与吡啶的体积比为1：5,反应温度为60℃,反应时间为3 h。改变硫酸化修饰条件得到6个不同DS的SSMG:其DS依次为0.25、0.61、0.82、1.13、1.67和2.83。与SMG比较,硫酸化修饰可提高其抗凝血、淋巴细胞增殖、抗炎和补体抑制活性。随着DS的不断提高,各活性也呈上升趋势,一般DS到达0.82后活性处于平稳阶段,DS过高则活性有所降低。硫酸化修饰对抗肿瘤和抗氧化活性没有提高作用。将SMG用淀粉酶酶解,过Sephadex G-100凝胶柱获得5个不同分子量（molecular weight, MW）的组分,对其进行硫酸化修饰,得到5个低分子量扇贝糖原硫酸酯（l0wmolecular weight sulfated scallop muscle glycogen, LSSMG）, MW分别为21.6、14.8、11.5、7.4和4.2 kDa。在此分子量范围内,LSSMG的抗肿瘤、淋巴细胞增殖活性和抗凝血中TT值都随MW增加而逐渐增强,而抗凝血活性的PT、APTT值和抗炎活性都随MW增大先增强后降低。此外,LSSMG的部分生物活性略强于SSMG,可能是分子量降低所致。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 概述
• 1.1.1 扇贝
• 1.1.2 糖原
• 1.2 多糖的化学修饰
• 1.2.1 多糖的硫酸化修饰
• 1.2.2 多糖的羧甲基化修饰
• 1.2.3 多糖的乙酰化修饰
• 1.2.4 多糖的磷酸化修饰
• 1.3 多糖的硫酸化修饰
• 1.3.1 多糖硫酸化修饰的方法
• 1.3.1.1 氯磺酸-吡啶法
• 1.3.1.2 浓硫酸法
• 1.3.1.3 三氧化硫-吡啶法
• 1.3.2 硫酸化修饰对多糖活性的影响
• 1.3.2.1 抗凝血活性
• 1.3.2.2 抗肿瘤活性
• 1.3.2.3 免疫活性
• 1.3.2.4 抗病毒活性
• 1.3.2.5 抗氧化活性
• 1.3.2.6 降血脂活性
• 1.4 论文的主要内容及研究意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验原料
• 2.1.2 酶制剂
• 2.1.3 药品与试剂
• 2.1.4 主要仪器与设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 基本组分测定
• 2.2.2 扇贝糖原的提取及纯化
• 2.2.2.1 扇贝粗糖原的提取
• 2.2.2.2 扇贝粗糖原除蛋白
• 2.2.2.3 凝胶层析柱鉴定扇贝糖原的纯度
• 2.2.2.4 高效液相色谱法鉴定扇贝糖原的纯度
• 2.2.3 扇贝糖原的结构鉴定
• 2.2.3.1 扇贝糖原单糖组成的测定
• 2.2.3.2 扇贝糖原甲基化分析
• 2.2.4 扇贝糖原的硫酸化修饰
• 2.2.4.1 扇贝糖原的硫酸酯化方法
• 2.2.4.2 不同酯化试剂比例对扇贝糖原硫酸化修饰的影响
• 2.2.4.3 不同反应温度对扇贝糖原硫酸化修饰的影响
• 2.2.4.4 不同反应时间对扇贝糖原硫酸化修饰的影响
• 2.2.4.5 扇贝糖原硫酸化修饰条件的确定
• 2.2.5 扇贝糖原及其硫酸酯的性质研究
• 2.2.5.1 红外光谱分析
• 2.2.5.2 相对分子量的测定
• 2.2.6 不同分子量扇贝糖原硫酸酯的制备
• 2.2.6.1 扇贝糖原的酶解
• 2.2.6.2 不同分子量扇贝糖原的收集
• 2.2.6.3 不同分子量扇贝糖原的硫酸化
• 2.2.7 SSMG活性的测定
• 2.2.7.1 抗凝血活性的测定
• 2.2.7.2 抗肿瘤活性的测定
• 2.2.7.3 淋巴细胞增殖活性的测定
• 2.2.7.4 抗炎活性的测定
• 2.2.7.5 补体活性的测定
• 2.2.7.6 抗氧化活性的测定
• 2.3 统计学方法
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 扇贝闭壳肌基本组成的测定
• 3.2 扇贝糖原的提取及纯化
• 3.2.1 扇贝糖原的提取及纯化
• 3.2.2 扇贝糖原的纯度鉴定
• 3.2.2.1 凝胶层析柱纯度鉴定
• 3.2.2.2 高效液相色谱纯度鉴定
• 3.3 扇贝糖原的结构鉴定
• 3.3.1 扇贝糖原的单糖组成分析
• 3.3.2 扇贝糖原的甲基化分析结果
• 3.4 扇贝糖原硫酸酯化反应条件的优化
• 3.4.1 酯化试剂比例对扇贝糖原硫酸化修饰的影响
• 3.4.2 反应温度对扇贝糖原硫酸化修饰的影响
• 3.4.3 反应时间对扇贝糖原硫酸化修饰的影响
• 3.4.4 扇贝糖原硫酸酯化工艺条件优化结果与分析
• 3.4.5 扇贝糖原及其硫酸酯的红外光谱分析
• 3.5 硫酸取代度对SSMG活性的影响
• 3.5.1 不同硫酸取代度SSMG的制备
• 3.5.2 硫酸取代度对体外凝血的影响
• 3.5.3 硫酸取代度对抗肿瘤活性的影响
• 3.5.4 硫酸取代度对淋巴细胞增殖活性的影响
• 3.5.5 硫酸取代度对抗炎活性的影响
• 3.5.6 硫酸取代度对补体活性的影响
• 3.5.7 硫酸取代度对抗氧化活性的影响
• 3.6 分子量对SSMG活性的影响
• 3.6.1 不同分子量SSMG的制备
• 3.6.2 分子量对体外凝血的影响
• 3.6.3 分子量对抗肿瘤活性的影响
• 3.6.4 分子量对淋巴细胞增殖活性的影响
• 3.6.5 分子量对抗炎活性的影响
• 3.6.6 分子量对补体活性的影响
• 3.6.7 分子量对抗氧化活性的影响
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录