青花菜游离小孢子培养及其植株再生技术研究

论文摘要

本研究以8个青花菜F1为试材,采用游离小孢子培养方法,研究了影响小孢子胚胎发生、发育及植株再生的几个主要因素,并对小孢子胚胎发生及发育过程进行了细胞学观察,同时对获得的小孢子植株进行倍性鉴定,探讨了植株再生过程中染色体加倍及移栽技术。通过本研究,旨在完善青花菜小孢子培养技术。试验获得以下结果:1)基因型是影响青花菜小孢子胚诱导的关键因素之一。在8个供试材料中,5个获得了胚状体,占供试材料的62.5%,3个获得再生植株。其中Q7胚诱导率最高,达14.5胚/皿,XLX最低,为0.17胚/皿。2)花蕾大小对小孢子培养效果有很大影响。通过对4个青花菜基因型不同花蕾长度花粉染色观察表明,当花蕾长度为3.5-4.5 mm时,小孢子单核靠边期比例为54.6%-73.7%,是游离小孢子培养的适宜时期。3)较低大量元素浓度有利于青花菜小孢子胚诱导。利用大量元素减半的1/2NLN-13培养基不仅扩大了出胚基因型范围,胚状体诱导率也得到很大提高。4)活性炭对小孢子胚胎发生和发育有促进作用,对难成胚基因型作用效果尤为显著,适宜添加量为1滴/皿（约0.1 mg/mL）。5)蔗糖发度的影响。培养基中蔗糖浓度以13%为宜,但采取1/2NLN-17—1/2NLN-13（1/2NLN-17培养2 d后转入1/2 NLN-13）改变蔗糖浓度的方法更有利于诱导小孢子胚胎发生。6)高温预处理时间的影响。对于难出胚基因型,32℃预处理小孢子48 h与在相同温度下处理24 h相比,可以有效的促进其出胚。7)小孢子胚胎发生的细胞学观察表明,青花菜小孢子胚胎发生存在A（不对称分裂）和B（对称分裂）两种基本途径,但以B途径为主。8)植株再生因素研究。试验结果表明,胚状体的胚龄为30-35d且发育健壮子叶型胚再生成苗率最高,胚龄大于40 d成苗率显著降低。诱导青花菜胚状体成苗的适宜培养基为琼脂含量为1.2%的MS或B5培养基。9)“MS+3%蔗糖+1.0%琼脂”是青花菜小孢子植株继代和复壮培养适宜的培养基,“MS+0.2 mg/L NAA+3%蔗糖+0.8%琼脂”是小孢子植株生根适宜培养基。10)再生植株倍性鉴定与加倍。倍性水平分析结果显示,青花菜小孢子再生植株多数为单倍体,有少数四倍体和一倍、二倍嵌合体,二倍体率为30%-35%。经鉴定为单倍体的植株,用2%秋水仙素进行加倍。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 芸苔属作物游离小孢子培养研究进展
• 2 游离小孢子培养技术相关研究
• 2.1 小孢子胚状体发生因素研究
• 2.1.1 供体植株基因型
• 2.1.2 供体植株生理状况
• 2.1.3 小孢子发育时期、花蕾大小、取样时期及取样位置的影响
• 2.1.4 基本培养基
• 2.1.5 活性碳
• 2.1.6 激素
• 2.1.7 预处理对胚状体发生的影响
• 2.1.8 蔗糖浓度及更换培养基
• 2.1.9 花粉密度
• 2.2 小孢子胚胎发生与染色体加倍的研究
• 2.3 小孢子胚状体再生因素研究
• 2.3.1 胚状体类型
• 2.3.2 胚龄对植株再生的影响
• 2.3.3 培养基水分状况
• 2.4 小孢子再生植株的倍性研究
• 2.4.1 染色体倍性鉴定方法
• 2.4.2 小孢子再生植株倍性
• 2.4.3 染色体加倍技术
• 3 小孢子培养技术的应用
• 3.1 在常规育种中的应用
• 3.2 用于突变育种
• 3.3 在基因工程中的应用
• 3.4 利用小孢子诱导的植株群体进行遗传分析
• 3.5 用于种子生理研究及种质保存
• 4 存在的问题及展望
• 第二章 引言
• 1 课题的提出
• 2 课题研究内容、目的及意义
• 第三章 青花菜小孢子培养胚状体发生及发育的研究
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 供试植株的获得
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 培养基
• 2.3.2 花蕾大小的选择
• 2.3.3 小孢子的分离纯化
• 2.3.4 小孢子培养
• 2.3.5 小孢子胚诱导频率的研究
• 2.3.6 小孢子胚胎发生的细胞学观察
• 2.3.7 数据统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 花蕾大小与小孢子发育时期的关系
• 3.1.1 花粉发育时期形态观察
• 3.1.2 花蕾大小与小孢子发育时期的关系
• 3.2 不同因素对小孢子胚诱导频率的影响
• 3.2.1 基因型对小孢子胚胎发生的影响
• 3.2.2 基本培养基对胚胎发生的影响
• 3.2.3 活性炭对小孢子胚胎发生的影响
• 3.2.4 蔗糖浓度对胚胎发生的影响
• 3.2.5 高温预处理时间对胚胎发生的影响
• 3.2.6 小孢子胚胎发生及发育过程的细胞学观察
• 4 讨论
• 4.1 影响小孢子胚状体发生的因素
• 4.1.1 基因型
• 4.1.2 小孢子发育时期
• 4.1.3 培养基
• 4.1.4 高温预处理
• 第四章 青花菜小孢子胚成苗影响因素研究
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 胚状体再生因素研究
• 2.2.3 植株倍性测定
• 2.2.4 植株移栽与加倍处理
• 2.2.5 数据统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 琼脂浓度对胚状体再生的影响
• 3.2 胚龄对胚状体再生的影响
• 3.3 培养基类型对胚状体再生的影响
• 3.4 试管苗的继代培养与复壮
• 3.5 小孢子植株倍性鉴定
• 3.5.1 流式细胞仪测定
• 3.5.2 形态学鉴定
• 3.6 炼苗、加倍与移栽
• 4 讨论
• 4.1 胚状体再生成苗影响因素
• 4.2 小孢子植株倍性及染色体加倍
• 第五章 总结
• 1 结论
• 2 存在的问题及解决途径
• 2.1 试验存在问题
• 2.2 解决途径
• 3 展望
• 参考文献
• 附录
• 附录1 青花菜小孢子发育时期与花蕾长度的关系
• 附录2 NLN培养基配方
• 附录3 B5培养基配方
• 致谢