油葵PEPC基因保守序列的克隆及RNAi载体的构建

论文摘要

油葵（Helianthus annuus L.）是我国五大油料作物之一,具有耐寒耐旱,耐盐碱耐瘠薄,适应性广,对土壤要求不高等特性。早在本世纪50年代,品质遗传学家就有报道称,油菜籽中蛋白质的含量与油脂含量呈高度的负相关关系,在其中起重要作用的关键酶则是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）。现在在油菜和大豆上已经有PEPC敲除实例,其对产油量确实产生了一定的促进作用。鉴于油葵PEPC基因未知,本研究根据亲缘较近物种的PEPC基因同源克隆了油葵PEPC基因mRNA的部分序列,同源比对找到两个进化保守区,构建RNAi表达载体,以期能够提高油葵的含油量。本研究得到实验结果如下:（1）用同源克隆的方法得到了油葵PEPC基因以及mRNA的部分序列。由于油葵中对该基因的研究还没有报道,因此需要以此序列再到GENEBANK中进行比对。比对结果显示,所扩增片段与GENEBANK中其他物种PEPC序列同源性极高,尤其是与油葵同科植物黄花菊属和青蒿的同源性为最高,与黄花菊属中不同植物的PEPC基因相似度达到92%以上,说明所得序列可以判断为油葵PEPC基因部分序列。（2）在油葵PEPC基因中通过比对找到两个保守区,根据RNAi要求dsRNA的大小,以及pTCK-303载体中的酶切位点,设计引物,克隆这两个片段,并连入了T载体测序无误。分别正反向连入载体pTCK-303,成功构建油葵PEPC基因的RNAi载体pTCK303-FP1-RP1和pTCK303-FP2-RP2。（3）通过比较,确定油葵的组织培养植株再生的最佳外植体为茎尖周缘分生区。其愈伤诱导率和不定芽的诱导率都高于其他外植体。最佳不定芽诱导培养基为MS +IAA(0.03 mg·L-1)+6-BA(1.4～1.6 mg·L-1),诱导率可达76.67%。在培养基1/2MS + NAA(0.3 mg·L-1)上进行生根培养,所有不定芽均可生根,且须根较多,利于组培苗的移栽成活。经过油葵花粉管通道法转化的探索,确定其可以得到阳性种子,为下一步研究奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.1.1 油葵研究进展
• 1.1.2 油葵油的应用价值
• 1.2 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因工程研究进展
• 1.3 RNAi 技术研究进展
• 1.3.1 RNAi 的历史背景
• 1.3.2 RNAi 的作用机制
• 1.3.3 RNAi 技术的特点
• 1.3.4 RNAi 在植物中的研究及作物改良方面的应用
• 1.4 本研究的目的与意义
• 第2章 油葵PEPC 基因序列的克隆
• 2.1 材料与设备
• 2.1.1 供试材料
• 2.1.2 生化试剂及配置
• 2.1.3 试验用具及仪器
• 2.2 试验内容与方法
• 2.2.1 简并引物设计及合成
• 2.2.2 油葵基因组DNA 的提取
• 2.2.3 PCR 扩增
• 2.2.4 PCR 产物的回收及测序
• 2.2.5 PCR 产物的比对
• 2.2.6 特异引物的设计及合成
• 2.2.7 总RNA 的提取及cDNA 合成
• 2.2.8 油葵PEPC 基因片段的扩增及测序
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 油葵基因组DNA 提取及检测
• 2.3.2 油葵总RNA 的提取及检测
• 2.3.3 油葵PEPC 基因序列的扩增及同源性分析
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第3章 油葵PEPC 基因保守序列的RNAi 载体构建
• 3.1 材料与设备
• 3.1.1 供试材料
• 3.1.2 生化试剂及配置
• 3.1.3 试验用具及仪器
• 3.2 试验内容与方法
• 3.2.1 油葵PEPC 基因保守序列的选择与确定
• 3.2.2 PCR 引物的设计
• 3.2.3 E.coli DH5α感受态细胞的制备
• 3.2.4 油葵PEPC 基因保守序列的克隆
• 3.2.5 载体pTCK303-FP1 的构建及检测
• 3.2.6 载体pTCK303-FP1-RP1 的构建及检测
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 保守序列的确定
• 3.3.2 PEPC 基因片段的克隆
• 3.3.3 pTCK303-FP 的构建
• 3.3.4 载体pTCK303-FP-RP 的构建
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第4章 油葵再生体系的建立及转化方法的探索
• 4.1 材料与设备
• 4.2 实验内容与方法
• 4.2.1 油葵再生体系的建立
• 4.2.2 转化方法的探索
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 不同外植体及激素配比对不定芽诱导的影响
• 4.3.2 不同激素对生根的影响
• 4.3.3 种子的GUS 染色
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 结论
• 附录
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间所发表的论文
• 致谢