鲤脑组织低温差异表达候选基因的筛选、cDNA全长克隆及功能预测

论文摘要

为从基因表达水平上研究鱼类耐低温机制,选取东北地区具有耐低温性状的黑龙江鲤（Cyprinus carpio）为实验材料,采用双标准曲线相对实时荧光定量PCR法进行基因表达量差异检测。鉴于在温度发生变化的过程中,脑部是神经中枢,同时也是参与体温调节的重要组织,其中的基因表达变化通常是最快、最灵敏的。通过查阅文献,收集并下载前人报道的鲤脑组织在低温下诱导表达的EST序列50个,根据荧光定量RT-PCR的扩增特点和要求,设计50个候选基因的引物使其扩增片段大小在100～200 bp之间。将黑龙江野鲤分别设23℃常温对照组和6℃低温待测组,采集鲤脑组织提取RNA并反转录成cDNA。随机挑选2个模板用普通PCR法对50对引物进行筛选,结果有26个候选基因及内参基因的引物扩增条带清晰、唯一。使用Rotor gene3000定量PCR仪,采用双标准曲线法,分别以23℃常温对照组和6℃低温待测组的黑龙江鲤脑组织cDNA为模板,以18S rRNA为内参基因,检测26个候选基因的相对表达量。实验数据经显著性分析发现,有5个候选基因在低温条件下表达量显著上升（P<0.01）,与对照组相比它们的表达量分别上升了2.11倍、13.9倍、2.52倍、7.38倍和1.83倍,基因功能比对结果表明其编码蛋白产物分别是脂肪酸链延伸酶（ELO）,酰基辅酶A脱氢酶（SCD）,转录起始因子IIB（TFIIB）,肌醇-1-磷酸合成酶（MIPS; EC 5.5.1.4）,血脑屏障HT7抗原（basigin）;有7个候选基因在低温下表达量分别下降了21.8%、25.9%、16.6%、23.7%、15.8%、16.3%、42.5%,但对照组和待测组差异不显著（P>0.05）,基因功能比对发现它们主要参与抑制糖酵解,促进细胞凋亡和干扰神经系统的重塑活动。将鲤鱼5个候选基因的序列在NCBI斑马鱼数据库中进行blast同源比对,发现其中4个候选基因均与斑马鱼（Danio rerio）同源,仍以18S rRNA为内参基因,检测上述4个候选基因在斑马鱼脑组织中的表达差异。结果表明低温条件下脂肪酸链延伸酶、酰基辅酶A脱氢酶、转录起始因子IIB、血脑屏障HT7抗原4个基因的表达量分别是常温对照组的0.76倍,1.62倍,1.36倍和1.05倍,表达量差异不显著（P>0.05）。鲤鱼及斑马鱼定量结果充分说明上述5个基因很有可能与鱼类耐低温性状密切相关,根据其各自参与的机体代谢功能推测,低温条件诱导鲤鱼某些基因的表达,通过加强不饱和脂肪酸代谢活动,神经系统调节作用,细胞转录活动及脑部细胞内外的物质运输及交换作用,以达到对冷环境的适应。5个鲤脑组织低温差异表达候选基因的获得为进行不耐低温鱼类的基因工程育种提供了基因元件。使用Clontech的SMARTer? RACEcDNA扩增试剂盒分别扩增5个候选基因的5’及3’端cDNA序列,测序后利用DNAstar-SeqMan程序拼接出重叠群（contig）序列,去除通用引物序列后得到每个基因的全长cDNA序列,并向NCBI提交序列信息,获取登录号分别为JF836160、JF836162、JF836163、JF836164、JF836165,cDNA全长分别为2737 bp、2618 bp、1555 bp、2154 bp、1971 bp。利用NCBI ORF finder软件寻找5个基因的开放性读码框（ORF）,读码框长度分别为876 bp,975 bp,951 bp,1659 bp,840 bp。用DNAstar Editseq软件将每个基因的最长正义链相位点ORF翻译成蛋白质序列,5个基因编码的蛋白质序列长度分别为291 aa,324 aa,316 aa,552 aa及279 aa。使用protparam、protscale、TMHMM、PHD、InterProScan、SWISS-MODEL等软件预测5蛋白质理化性质、二级结构及高级结构。结构域预测结果表明5个蛋白质的功能分别为脂肪酸链延伸酶、脂肪酸脱氢酶、转录起始因子IIB、肌醇-1-磷酸合成酶及Basigin蛋白;蛋白质同源建模结果表明转录起始因子IIB及肌醇-1-磷酸的合成酶的同源蛋白三维结构已经有所研究,但对于脂肪酸延伸酶、脂肪酸脱氢酶及Basigin蛋白的三维结构还知之甚少。根据各自的氨基酸序列Blastp结果,运用MEGA4.0软件构建分子进化树,分子进化树结果表明,鲤鱼蛋白质进化距离与属冷水鱼类的大西洋鲑（Salmo salar）及属温水性鱼类的草鱼（Ctenopharyngodon idellus）最近,而与属热带鱼类的斑马鱼、遮目鱼（Chanos chanos）稍远,说明这些蛋白功能与鱼类的温度适应性紧密相关。为准备后续转基因实验,选取Tol2转座子载体作为转基因载体。由于受Tol2转座子载体上片段插入酶切位点的限制,只有脂肪酸脱氢酶的ORF序列可以完整插入载体中,并成功构建转脂肪酸脱氢酶基因Tol2载体,为下一步转基因工作准备好实验材料。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1.1 鱼类耐低温研究进展
• 1.2 实时荧光定量PCR 实验方法及应用
• 1.2.1 荧光定量 PCR 原理
• 1.2.2 荧光定量 PCR 方法分类
• 1.2.3 荧光定量 PCR 的应用
• 1.3 RACE 技术进展
• 1.4 转基因技术研究进展
• 第二章 鲤脑组织低温差异表达候选基因的筛选
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 RNA 提取及cDNA 模板的制备
• 2.2.2 鲤耐低温EST 序列来源及引物设计
• 2.2.3 引物的筛选
• 2.2.4 质粒标准品的制备
• 2.2.5 荧光定量 PCR 反应
• 2.2.6 双标准曲线的制备及数据转换
• 2.2.7 数据统计方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 RNA 提取质量及单链cDNA 合成结果
• 2.3.2 特异性引物筛选结果
• 2.3.3 质粒标准品质量检测及双标准曲线分析
• 2.3.4 各基因相对定量结果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 双标准曲线相对定量 PCR 法的应用
• 2.4.2 表达量显著上升基因的功能分析
• 2.4.3 表达量下降基因的功能分析
• 第三章 斑马鱼中候选基因表达量的验证
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 序列来源及引物设计
• 3.2.2 双标准曲线相对定量 PCR 法
• 3.3 斑马鱼定量实验结果
• 3.3.1 引物信息及筛选结果
• 3.3.2 双标准曲线结果
• 3.3.3 斑马鱼定量结果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 双标准曲线定量 PCR 体系优化及实验技巧
• 3.4.2 比较4 个基因在鲤鱼和斑马鱼的表达量差异
• 第四章 5 个基因全长cDNA 的克隆
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 SMARTer RACE cDNA 扩增原理
• 4.2.2 SMARTer RACE cDNA 扩增步骤
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 5'-RACE PCR 及3'-RACE PCR 扩增结果
• 4.3.2 5 个基因测序结果分析及cDNA 全长拼接
• 4.4 讨论
• 4.4.1 RACE 实验操作要领
• 4.4.2 cDNA 全长的获得及其意义
• 第五章 生物信息学方法预测蛋白质结构及功能
• 5.1 实验方法
• 5.1.1 寻找开放阅读框（ORF）
• 5.1.2 基因同源性分析及结构分析
• 5.1.3 蛋白质理化性质分析
• 5.1.4 蛋白质二级结构预测
• 5.1.5 蛋白质结构域分析
• 5.1.6 蛋白质三级结构预测
• 5.1.7 蛋白质序列比对及分子系统发生分析
• 5.2 结果
• 5.2.1 ORF 位点及蛋白质序列
• 5.2.2 各目的基因全长cDNA 同源比对
• 5.2.3 U5 基因组转录调控序列分析
• 5.2.4 蛋白质理化性质分析结果
• 5.2.5 蛋白质二级结构预测结果
• 5.2.6 蛋白质结构域预测结果
• 5.2.7 蛋白质三级结构预测结果
• 5.2.8 蛋白质分子进化树建立
• 5.3 讨论
• 5.3.1 同源建模法预测蛋白质三维结构
• 5.3.2 蛋白质结构与功能
• 5.3.3 进化树与蛋白质功能
• 5.3.4 鲤鱼耐低温机制预测
• 第六章 转脱氢酶基因 Tol2 载体的构建
• 6.1 Tol2 转座子结构特征及工作原理
• 6.2 实验材料
• 6.3 转基因Tol2 载体构建步骤
• 6.4 结果
• 6.4.1 引物设计结果及 PCR 扩增结果
• 6.4.2 转基因 Tol2 载体构建结果
• 6.5 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表学术论文