表达人血清白蛋白-C肽融合蛋白毕赤酵母工程菌的构建

论文摘要

C肽（C-Peptide,CP）是胰岛素A链与B链之间的连接肽,近年来研究发现CP通过与细胞膜上G蛋白耦联的受体结合,使Ca2+通道开放,激活Na+-K+-ATP酶活性和一氧化氮合酶的活性,增加血流量,扩张血管,从而改善糖尿病患者的肾脏、神经、微血管病变。为了加快CP的药物化进展,提高CP在体内的半衰期,我们构建了人血清白蛋白（HSA）-CP融合蛋白,将其在毕赤酵母系统中进行表达,并对表达的融合蛋白进行了鉴定、活性分析和初步的分离纯化。根据表达系统的密码子偏好性优化CP基因,PCR从T-CP质粒中扩增CP基因,酶切连接pBlue-HSA质粒（HSA1800bp）和CP（100bp）基因,构建pBlue-HSA-CP质粒。测序结果显示得到的融合基因HSA-CP序列与预期一致。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切重组质粒pBlue-HSA-CP,回收HSA-CP片段,插入分泌表达载体pPIC9k中,构建表达载体pPIC9k-HSA-CP。表达载体pPIC9k-HSA-CP经限制性内切酶分析和PCR验证表明,融合基因已经成功的插入到载体pPIC9k中。表达载体pPIC9k-HSA-CP经SalⅠ线性化后电击转化毕赤酵母GS115,用MM和MD平板筛选Mut+转化子,PCR鉴定后,用甲醇诱导摇瓶分泌表达。将表达量较高的重组子进行表达产物鉴定和活性分析,优化诱导时间和诱导剂浓度后,对融合蛋白进行初步的分离纯化。经G418筛选得到能耐受3 mg/mL G418重组菌8株,进一步摇瓶诱导筛选得到两株表达量120 mg/L的重组菌rHC1, rHC2。优化摇瓶培养条件后,重组菌表达量由120 mg/L提高到140 mg/L。Western blot鉴定显示表达的融合蛋白具有HSA和CP的抗原性,为HSA和CP的杂合分子,分子量约为70 kDa。细胞活性研究表明HSA-CP融合蛋白对人胚肾293细胞的生长具有一定的促进作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 C 肽
• 1.1.1 C 肽概况
• 1.1.2 C 肽基因及其结构特点
• 1.1.3 C 肽作用机制及研究进展
• 1.1.4 C 肽药物化前景及存在问题
• 1.2 长效重组蛋白
• 1.2.1 研究背景
• 1.2.2 点突变技术
• 1.2.3 长效剂型
• 1.2.4 化学修饰
• 1.2.5 基因融合
• 1.3 立题背景及研究内容
• 第二章 表达载体PPIC9K-HSA-CP 的构建
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 工具酶
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 CP 基因的密码子优化
• 2.2.2 T-CP 质粒的提取
• 2.2.3 PCR 扩增CP 基因
• 2.2.4 PCR 扩增的CP 基因的纯化
• 2.2.5 重组质粒pBlue-HSA-CP 的构建
• 2.2.6 DH5α感受态细胞的制备及转化
• 2.2.7 重组质粒pBlue-HSA-CP 的鉴定
• 2.2.8 表达载体 pPIC9k-HSA-CP 的构建
• 2.2.9 表达载体 pPIC9k-HSA-CP 的鉴定
• 2.3 结果
• 2.3.1 PCR 扩增C 肽基因
• 2.3.2 重组质粒pBlue-HSA-CP 的构建
• 2.3.3 重组质粒的序列测定
• 2.3.4 表达载体pPIC9k-HSA-CP 的构建
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 毕赤酵母工程菌的构建与表达产物的鉴定
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 工具酶与试剂
• 3.1.4 仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 线性化pPIC9k-HSA-CP 片段的制备
• 3.2.2 毕赤酵母 GS115 感受态细胞的制备
• 3.2.3 毕赤酵母 GS115 感受态细胞的转化
• 3.2.4 高拷贝重组子的筛选
• 3.2.5 MM 平板和MD 平板筛选Mut+和Muts 型重组子
• 3.2.6 毕赤酵母基因组DNA 的提取
• 3.2.7 重组毕赤酵母的PCR 鉴定
• 3.2.8 高表达毕赤酵母 GS115 重组子的筛选
• 3.2.9 发酵液中融合蛋白的HSA-CP 的Western blot 鉴定
• 3.3 结果
• 3.3.1 重组毕赤酵母菌的构建及筛选
• 3.3.2 重组毕赤酵母菌的PCR 鉴定
• 3.3.3 高表达毕赤酵母 GS115 重组子的筛选
• 3.3.4 融合蛋白的Western blot 鉴定
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 融合蛋白的生物活性测定及罐上发酵条件初试
• 4.1 材料
• 4.1.1 细胞株
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 工具酶和试剂
• 4.1.4 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 融合蛋白摇瓶发酵条件的初步优化
• 4.2.2 融合蛋白的初步分离纯化
• 4.2.3 融合蛋白的活性测定
• 4.2.4 发酵罐上无机盐培养基和有机培养基对融合蛋白表达的影响
• 4.3 结果
• 4.3.1 融合蛋白表达条件初步优化
• 4.3.2 融合蛋白的初步分离纯化
• 4.3.3 融合蛋白的活性测定
• 4.3.4 发酵罐上无机盐培养基和有机培养基对融合蛋白表达的影响
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 论文总结
• 一、 主要结论
• 二、 论文创新意义
• 三、 存在问题及展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文