鲑鱼降钙素在酵母中的多拷贝表达及安全性评价

论文摘要

十九世纪六十年代,降钙素（Calcitonin, CT）作为一种降血钙的物质被copp发现。它在哺乳动物中起源于甲状腺C细胞,在鱼类中后腮体分泌。降钙素是由哺乳动物的甲状腺C细胞或鱼类的后腮体分泌的多肽类激素,由32个氨基酸残基组成,主要参与体内的钙、磷代谢。在体内的主要作用是通过抑制破骨细胞活性,减少骨质吸收,促进钙在骨中的沉积,从而降低血钙浓度降钙素的这种抗骨吸收活性使降钙素能够被广泛的使用于治疗Paget综合症,骨质疏松,以及高钙血症。不同来源的降钙素氨基酸序列不同,其中后鳃体来源的降钙素活性高于甲状腺来源的降钙素。鲑鱼降钙素（salmon calcitonin, sCT）的生物活性最高（4 000IU/mg-7 000IU/mg）,相当于人降钙素生物活性（200 IU/mg）的30-40倍。由于降钙素的天然来源有限,化学合成降钙素成本较高,从而在一定程度上限制了降钙素的普遍应用。国内外已有多个研究机构进行了基因工程降钙素的研究,并且已经有产品在欧洲上市。多肽类药物在过去的二十年里得到了迅速的发展,但是降钙素已经开发的剂型只有注射和鼻腔给药两种形式,临床主要采用注射给药,患者长期用药极为不便,依从性差,目前,国内外均在加大鲑鱼降钙素口服剂的研究,以更大范围的满足临床需求。由于多肽类药物易于在胃肠中发生降解,因此,提高多肽抵抗蛋白酶降解能力便成为鲑鱼降钙素口服剂广泛应用的首要因素。近来,许多研究表明酿酒酵母对于多肽类药物是一个合适的运载载体。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）具有生长旺盛,易培养,生物量大,公认安全等优良特点,是发酵工业的重要微生物之一。酵母基因组中rDNA片断有100-200个重复单元,是提高外源基因的稳定性和表达量,构建多拷贝整合型载体较为理想的重复顺序。2001年,Blanquet等成功实现了植物细胞色素P450 73A1（生物体内一种重要的酶）在酵母中的表达,提出了应用酿酒酵母为载体实现药物的口服给药途径,该方法制成的药物被称“biodrug”。在以酵母为载体的“biodrug”模式研究中发现,冷冻干燥的重组酵母对人工模拟胃肠环境下的消化酶表现出了较强的耐受性,能够对表达产物能起到良好的保护作用,而且目前研究较多的口服型肠溶微粒模式证明,鲑鱼降钙素能够以多肽的形式直接穿过动物胃肠道的表皮细胞进入血液。本文以此为依据进行了鲑鱼降钙素口服途径的相进行了鲑鱼降钙素口服途径的相关研究,测定转鲑鱼降钙素酵母的体外活和体内活性,为鲑鱼降钙素口服途径应用提供一个新的方法。根据酵母整合质粒的设计要求,PCR扩增2.2 kb rDNA片段,导入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）整合载体pYD1中,设计并合成适合在酵母中表达的鲑鱼降钙素（Salmon Calcitonin）,以此为目标基因,构建适合酿酒酵母多拷贝整合的表达载体p-r-sCT。通过载体p-r-sCT引入到酿酒酵母菌株EBY100中,得到酵母重组菌株yAGA2-r-sCT,并通过细胞实验和动物实验进行了活性检测。利用间接荧光标记的方法,在荧光显微镜下观察到了转化子yAGA2-V5和yAGA2-r-sCT外源蛋白的表达。进一步的流式细胞仪分析显示,表达开始12小时之后,yAGA2-sCT中有80 %的细胞表达外源蛋白,yAGA2-V5转化子中有52 %的细胞表达外源蛋白。在肠激酶的作用下,转基因酵母中的外源蛋白释放到酶切液的上清当中。该上清简称为EKS。外源表达的蛋白通过细胞实验对其体外的活性进行了检测。结果发现yAGA2-r-sCT EKS能够显著减少骨陷窝的生成,即重组鲑鱼降钙素能够在体外抑制破骨细胞的活性。体外降血钙实验中,重组鲑鱼降钙素能够明显降低大鼠体内血钙浓度,证明重组鲑鱼降钙素具有体外活性。取转基因酵母分别以高（2 g/kg）、中（0.5 g/kg）、低（0.1 g/kg）三种剂量组对高钙血症模型大鼠灌胃给药,口服2 g/kg冷冻干燥后的转基因酵母可以使高钙血症模型Wistar大鼠的血钙浓度由2.818±0.232 mM降低为2.475±0.0191 mM。口服转鲑鱼降钙素基因酵母为鲑鱼降钙素的应用开辟了一条新的途径。为评价转鲑鱼降钙素基因酵母的安全性,将转基因酵母分别灌胃昆明种小鼠和Wistar大鼠进行急性毒性实验（7天）、亚急性毒性实验（8周）。急性毒性实验结果显示灌喂转基因酵母对大鼠无致死效应（LD50>10000 mg/kg）。亚急性毒性实验中,高（2.0 g/kg）、低（0.5 g/kg）剂量组动物的一般状况、体重、主要脏器系数、血液学指标及血液生化指标与各对照组比较,均未见明显差异（p>0.05）.组织病理切片检查未发现病理性变化。实验结果充分证明转鲑鱼降钙素基因酵母不能对实验动物造成不良影响,是安全无毒的。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述和立项依据
• 第一节 降钙素的研究进展
• 1 降钙素概述
• 2 降钙素的生物活性与作用机理
• 3 鲑鱼降钙素在原核与真核载体中的表达
• 4 外源表达鲑鱼降钙素后的酰胺化处理
• 5 降钙素的临床应用及其制剂
• 6 鲑鱼降钙素的研究发展趋势
• 第二节 酵母表面展示载体研究进展
• 1 酿酒酵母的表面结构
• 2 酿酒酵母细胞表面工程两种系统
• 3 酿酒酵母表面展示系统的特点
• 第三节 破骨细胞骨吸收机制研究进展
• 1 破骨细胞增殖与分化的分子生物学
• 2 骨吸收过程中破骨细胞的活动与变化
• 3 破骨细胞在骨组织工程中的应用
• 第四节 转鲑鱼降钙素基因酵母的安全性评价
• 1 转基因食品对环境及生态可能造成的危害
• 2 转基因食品对人类健康可能产生的危害
• 3 转基因食品的安全性评价
• 4 转基因食品无害性评估的几个方面
• 5 安全性分析的内容
• 6 转基因食品的展望
• 第五节 研究课题的提出及立项依据
• 第二章 鲑鱼降钙素基因的设计与克隆及多拷贝整合载体的构建-
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三章 鲑鱼降钙素在酿酒酵母中的多拷贝表达
• 第一节 鲑鱼降钙素向酿酒酵母的转化
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二节 免疫荧光检测外源基因的表达
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三节 流式细胞技术检测外源蛋白在酵母细胞表面的表达-
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第四章 重组鲑鱼降钙素的活性研究及在酵母中表达量的测定
• 第一节 重组鲑鱼降钙素对破骨细胞活性的抑制
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二节 重组酿酒酵母的体外降血钙活性
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第五章 口服转鲑鱼降钙素基因酵母对高钙血模型大鼠的作用
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第六章 转鲑鱼降钙素基因酿酒酵母的生物安全性评价
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 结论
• 1 鲑鱼降钙素基因在转基因酵母 yAGA2-r-sCT 中得到了表达
• 2 重组鲑鱼降钙素蛋白的体外活性
• 3 转鲑鱼降钙素基因酵母 yAGA2-r-sCT 具有持续降血钙活性
• 4 转鲑鱼降钙素基因酵母 yAGA2-r-sCT 具有抑制高钙血症活性
• 5 证明转鲑鱼降钙素基因酵母 yAGA2-r-sCT 是安全无毒级
• 参考文献
• 文章发表状况
• 致谢