GLP-1及其类似物对HepG2细胞糖异生作用的影响及机制探讨-PI3K通路

论文摘要

目的：1.体外培养人肝肿瘤细胞HepG2细胞系。2.研究胰高血糖素样肽-1 （glucagon-like peptide-1, GLP-1）及其类似物Exendin-4对HepG2细胞糖异生作用的影响并探讨其作用机制-PI3K（phosphatidylinositol 3 kinase）通路。3.为GLP-1及其类似物有效的降糖、更有针对性地改善糖代谢,为临床治疗提供初步的理论依据。方法：1.体外培养人肝肿瘤细胞HepG2细胞系,通过倒置显微镜形态学观察。2.将培养的HepG2细胞随机分为4个干预组,每组五个样本,四组分别为Control组,insulin（INS）（10nmol/L）干预组,GLP-1（10nmol/L）干预组,Exendin-4（10nmol/L）干预组,各组的五个样本分别干预0h,4h,8h,16h,24h五个时间点,提取细胞总蛋白,检测磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Phosphoenol pyruvate carboxy kinase,PEPCK）的蛋白表达量,描绘出PEPCK表达随时间变化的趋势曲线,选取合适的药物干预时间,作为药物的最终干预时间。3.将培养的HepG2细胞随机分为9组：①Control组,②INS（10nmol/L）组,③GLP-1（10nmol/L）组,④Exendin-4（10nmol/L）组,⑤GLP-1 （10nmol/L）+INS（10nmol/L）组,⑥Exendin-4（10nmol/L）+INS（10nmol/L）组,⑦LY294002（15μmol/L）组,⑧GLP-1（10nmol/L）+LY294002 （15μmol/L）组,⑨Exendin-4（10nmol/L）+LY294002 （15μmol/L）组,分别干预上述时间后,用蛋白质印迹（western blot）法测定各组PEPCK蛋白的表达量。结果：1.人肝肿瘤细胞HepG2细胞系的传代培养情况良好。2.各实验组INS（10nmol/L）组,GLP-1（10nmol/L）组,Exendin-4（10nmol/L）组,GLP-1（10nmol/L）+INS（10nmol/L）组,Exendin-4（10nmol/L）+INS （10nmol/L）组,LY294002（15μmol/L）组,GLP-1（10nmol/L）+LY294002 （15μmol/L）组, Exendin-4 （10nmol/L）+LY294002（15μmol/L）组,与对照组相比,HepG2细胞的形态未见明显改变,药物干预24h内对照组与各药物干预组细胞形态完好。3.蛋白印记法测对照组及各药物干预组在不同时间点的PEPCK表达量,发现Control组,4hPEPCK蛋白表达明显上升,16h后曲线变化趋于平稳；INS、GLP-1、Exendin-4组在8hPEPCK的蛋白表达量与同组4h比较明显减少,8h后PEPCK蛋白表达曲线趋于平稳,变化幅度不明显,故选取8h作为药物最佳干预时间。4.对照组以及8个实验组在不同药物以一定浓度干预8h后western blot结果表明：（1）与Control组相比,GLP-1组（10nmol/L）、INS组（1 Onmol/L）、Exendin-4 （1 Onmol/L）组的PEPCK的表达量均明显减少（p<0.05）,表明INS、GLP-1、Exendin--4能降低HepG2细胞中PEPCK的蛋白表达量；（2）与INS（10nmol/L）组相比,GLP-1 （10nmol/L）+INS（10nmol/L）组、Exendin--4（10nmol/L）+INS（10nmol/L）组中PEPCK的蛋白表达量均明显减少（p<0.05）；表明GLP-1、Exendin-4分别与INS联合组对PEPCK蛋白表达的抑制有一定的叠加作用：（3）与Control组相比,LY294002（15μmol/L）组PEPCK的蛋白表达量无明显差异（p>0.05）,表明PI3K阻断剂LY294002单独应用对HepG2细胞中PEPCK的蛋白表达无明显影响；与GLP-1（10nmol/L）组相比,GLP-1（10nmol/L）+LY294002 （15μmol/L）组的PEPCK的蛋白表达量明显增加（p<0.05）,但与Control组相比明显减少（p<0.05）,表明PI3K的阻断剂LY294002部分阻断了GLP-1对HepG2细胞PEPCK的蛋白表达的抑制作用；与Exendin-4（1 Onmol/L）组相比,Exendin-4 （10nmol/L）+LY294002（15μmol/L）组的PEPCK的蛋白表达量明显增加（p<0.05）,但与Control组相比明显减少（p<0.05）,表明PI3K的阻断剂LY294002部分阻断了Exendin-4对HepG2细胞PEPCK的蛋白表达的抑制作用。结论：1.本研究通过体外实验验证了GLP-1及其类似物Exendin-4可直接作用于人肝肿瘤细胞HepG2细胞,影响糖异生关键酶PEPCK的蛋白表达,进而起到抑制肝糖异生的作用。2. GLP-1、Exendin-4分别与INS联合,对糖异生关键酶PEPCK的表达的抑制有一定的叠加作用。3.在GLP-1及Exendin-4干预的前30min予P13K阻断剂LY294002（15μmol/L）干预后,HepG2细胞中PEPCK的蛋白表达量相应较GLP-1及Exendin-4组上升,但未达到对照组水平,部分阻断了GLP-1及其类似物Exendin-4对HepG2细胞肝糖异生关键酶PEPCK表达的抑制作用。故可知,GLP-1及其类似物Exendin-4抑制HepG2细胞糖异生的作用可能是通过激活PI3K/Akt通路,使FoxOl（叉头蛋白O1,糖异生关键酶PEPCK的重要转录活化因子）磷酸化,导致FoxOl从细胞核中排除到细胞质失去转录活性,抑制PEPCK基因的转录,降低了PEPCK蛋白的表达,进而起到抑制HepG2的糖异生作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 对象和方法
• 1 人肝肿瘤细胞HepG2细胞系的体外培养
• 1.1 对象
• 2 Western blot方法测定PEPCK蛋白表达
• 2.1 对象
• 2.2 方法与步骤
• 3 凝胶图像分析
• 4 统计学处理
• 结果
• 1 人肝肿瘤细胞系HepG2细胞的体外培养
• 2 人肝肿瘤细胞系HepG2细胞PEPCK蛋白表达的western blot法检测及图像分析
• 2.1 western blot法检测PEPCK蛋白表达,选择最佳干预时间
• 2.2 人肝肿瘤细胞HepG2细胞一定浓度药物干预8小时的PEPCK蛋白的western blot法检测及图像分析
• 讨论
• 1 GLP-1及其类似物的来源、分泌及代谢
• 2 GLP-1及其类似物的作用
• 3 GLP-1及其类物介导的肝细胞糖代谢的信号转导途径
• 结论
• 参考文献
• 发表论文及参加科研情况说明
• 综述
• 综述参考文献
• 致谢