NMDA受体的激活在高氧暴露后新生大鼠肺损伤和肺泡发育受阻中的作用及机制研究

论文摘要

氧疗是临床上抢救治疗各种危重病人的重要措施之一。然而新生儿期长期吸入高浓度氧,可引起以中性粒细胞浸润为特征的弥漫性肺泡损害和以肺泡发育受阻及肺组织纤维化改变为主的慢性肺损伤。NMDA受体是谷氨酸受体的重要亚型,NMDA受体的过度激活可引起神经细胞内Ca2+超载和Na+蓄积,从而导致神经细胞的急性肿胀、迟发性坏死和凋亡。近年来发现在外周肺组织同样存在NMDA受体的表达,并参与急性肺损伤及弥漫性肺泡炎症反应。本室前期实验采用95%高浓度氧气持续暴露,成功建立了高氧致新生大鼠肺损伤模型。在此模型基础上证实高氧诱导肺组织释放内源性谷氨酸增加及NMDA受体表达增强,MK-801可减轻高氧诱导的新生大鼠肺损伤及炎症浸润程度,减轻持续高氧诱导的肺泡发育受阻及胶原的沉积,提示NMDA受体参与高氧诱导的慢性肺损伤的发生。但是NMDA受体参与高氧暴露后引起的新生大鼠肺泡发育受阻及肺组织纤维化的具体阶段及其机制尚不清楚。本实验将在整体及细胞水平深入探讨NMDA受体在高氧致新生大鼠慢性肺损伤中的作用及其机制。实验分为四部分:第一章:不同高氧暴露时间对新生大鼠的影响目的比较不同持续时间高氧暴露对新生大鼠肺组织的影响,选择较为理想的高氧致新生大鼠慢性肺损伤模型。方法孕22天顺产分娩新生大鼠生后2-4小时内编号并随机分为3组:空气对照组,7天高氧+亚高氧组,3天高氧+空气组。7天高氧+亚高氧组持续维持≥95%高氧暴露7天后改为持续60%亚高氧暴露至生后21天;3天高氧+空气组为持续≥95%高氧暴露3天后接受常压空气;空气对照组置于同一室内,接受常压空气。观察各组一般情况及死亡率,分别在生后3天,7天,14天,21天后在各组随机抽取实验动物处死,进行体重、肺重、肺指数及肺湿重/干重（W/D）的测定;支气管肺泡灌洗检测LDH活性、蛋白含量和白细胞计数;同时检测肺组织HYP含量及肺组织形态检查计算RAC值。结果1.高氧7天+亚高氧组生存能力低,发育落后,死亡率高,持续高氧暴露3天时,肺组织W/D,BALF中LDH活性、蛋白含量、白细胞计数均显著升高;持续高氧暴露7天时肺指数开始明显升高,而W/D、蛋白含量、白细胞计数进一步升高,LDH活性虽有所下降但仍然高于空气对照组,第14天肺指数进一步升高,而W/D、LDH活性、蛋白含量、白细胞计数虽有所下降,但仍显著高于空气对照组。持续高氧暴露7天后可以显著增加胶原沉积,14天后更为明显。肺组织形态学检查发现持续高氧暴露3天后可见肺泡内初学及炎症细胞浸润,持续高氧暴露7天时,可见肺泡内出血及肺泡炎症细胞浸润明显增加,肺间隔增宽,肺组织正常结构局灶性破坏,局部肺结构紊乱,终末气腔明显扩张、小肺泡数量减少。持续高氧暴露14天时,肺间隔更宽,肺间质大量血性渗出,肺组织正常结构破坏,终末气腔扩张更为明显、小肺泡数量更少。2.高氧3天+空气组一般情况与空气对照组比较无明显差别,存活率低于空气对照组但高于持续高氧暴露组,停止高氧暴露4天（生后7天）除肺指数及W/D外,BALF中LDH活性、蛋白含量及白细胞计数均与对照组无显著差异,且均显著低于持续高氧暴露组;停止高氧暴露11天（生后14天）,上述所有指标均与空气对照组无明显差异。HYP在停止高氧暴露11天（生后14天）后虽然低于持续高氧组,但开始显著高于空气对照组,在21天后增加更为明显。形态学检查发现停止高氧暴露4天（生后7天）时肺泡内则少见炎性渗出,与空气对照组无明显区别,14天时出现肺泡间隔增宽,21天时形成明显的纤维增生。结论1.持续高氧3天可以引起新生大鼠肺组织急性肺损伤及肺泡炎症的发生。随持续高氧暴露时间越长,新生大鼠急性高氧性肺损伤程度越重。2.在持续高氧7天后改为60%亚高氧继续暴露至生后14天,肺急性损伤及肺泡炎症相对减轻,而胶原沉积、肺泡发育受阻进一步加重。所有动物均不能存活至21天。3.3天短暂的高氧后,随生后时间延长虽然停止高氧暴露肺脏仍然会逐渐出现肺泡发育受阻及肺纤维化为特点的慢性损伤改变。第二章:高氧不同阶段应用MK-801对3天高氧暴露所致新生大鼠肺发育受阻及胶原沉积的影响目的比较在高氧致新生大鼠肺损伤不同阶段应用MK-801对肺损伤的影响,探寻NMDA受体在高氧致新生大鼠慢性肺损伤发生发展中的作用方法孕22天顺产分娩新生大鼠生后2-4小时内编号并随机分为六组:空气对照组,空气+MK-801 A组（出生1-3天使用MK-801）,空气+MK-801 B组（出生8-10天使用MK-801）,高氧组,高氧+MK-801A组（高氧暴露同时使用MK-801）,高氧+MK-801 B（高氧暴露停止4天后开始使用MK-801）组。其中高氧组、高氧+MK-801A组和高氧+MK-801 B组新生大鼠生后即置于≥95%氧仓中持续高氧暴露3天后接受常压空气;空气+MK-801 A组和高氧+MK-801 A组新生大鼠生后1天开始每日腹腔注射MK-801 0.05mg/kg,连用3天;空气+MK-801 B组和高氧+MK-801 B组在生后8开始每日腹腔注射MK-801 0.05mg/kg,连用3天。分别在生后的第3天,第7天,第14天,第21天处死动物。进行体重、肺重、肺指数及肺湿重/于重（W/D）的测定;支气管肺泡灌洗检测LDH活性、蛋白含量和白细胞计数;同时检测肺组织HYP含量:检测肺组织病理学形态检查,计算RAC值;在在后21天时进行肺功能的检测。结果1.高氧暴露1-3d时应用MK-801（高氧+MK-801 A组）,可以减轻高氧导致的生后3天及7天肺泡损伤及弥漫性炎症反应,降低生后3天及7天高氧致W/D及肺指数的升高,降低生后14天及21天高氧致HYP含量的升高,改善高氧致肺纤维化程度及肺泡发育受阻,改善高氧所致生后21天时肺顺应性的下降。2.高氧暴露3d后至生后8-10d应用MK-801（高氧+MK-801 B组）,HYP含量、肺顺应性在生后14天和/或21天明显低于高氧组,但高于高氧+MK-801 A组;RAC值高于高氧组,低于高氧+MK-801 A组。结论首次发现NMDA受体阻断剂MK-801对高氧致新生大鼠肺损伤的保护作用除了减轻早期细胞损伤及炎症反应外,还可以直接抑制高氧诱导的肺组织胶原沉积及肺泡发育受阻。提示NMDA受体的激活参与了高氧诱导的慢性肺损伤的发展。第三章:NMDA受体的激活对人胎肺成纤维细胞胶原分泌和自身降解的影响目的:检测NMDA受体在人胎肺成纤维细胞上的表达,并观察其在人胎肺成纤维细胞胶原分泌与自身降解中的作用。方法1.免疫组织化学及免疫荧光染色法检测人胎肺成纤维细胞NMDAR1,NR2D表达,实时定量PCR方法（Real Time PCR）检测人胎肺成纤维细胞NR1和NR2A,NR2B、NR2C和NR2D受体亚单位mRNA表达。2.直接细胞计数法及MTT检测不同浓度谷氨酸或NMDA对人胎肺成纤维细胞增殖的影响。3.检测不同浓度谷氨酸或NMDA对人胎肺成纤维细胞培养上清液中HYP的影响。4.ELISA法检测NMDA对人胎肺成纤维细胞培养上清液中Ⅰ,Ⅲ型胶原及MMP-1,TIMP-1分泌的影响结果1.正常人胎肺成纤维细胞上存在NMDARs mRNA表达,并且五种受体表达程度并不相同,以NMDAR2A及NMDAR2D表达最强,随后依次为NMDAR2C、NMDA2B和NMDAR1。免疫组化及免疫荧光显人胎肺成纤维细胞存在NMDAR1及NR2D的表达。2.直接细胞计数显示在试验72小时后1mM谷氨酸及1mM NMDA组与其他组相比明显促进人胎肺成纤维细胞增殖,1mM谷氨酸显著高于1mM NMDA组,10mM谷氨酸组与其他组相比抑制增殖。其余各组无显著差异。MTT法显示1mM谷氨酸组与对照组相比MTT值明显增加,MK-801可抑制1mM谷氨酸引起的MTT增加。1mM NMDA组MTT值明显低于1mM谷氨酸组,并与对照组比无显著差异。单独加入MK-801组与对照组及加入NMDA培养细胞无显著差异。3.人胎肺成纤维细胞上清液中HYP的测定显示1mM NMDA组与对照组比较显著增高,1mM谷氨酸组与对照组比较显著增高,NMDA组显著高于谷氨酸组。MK-801可以抑制NMDA或谷氨酸诱导的HYP的升高。4.正常培养人胎肺成纤维细胞存在基础的Ⅰ/Ⅲ型胶原及MMP-1/TIMP-1分泌。NMDA组与对照组比较,Ⅰ/Ⅲ型胶原含量及TIMP-1分泌显著增加,对MMP-1分泌无显著影响。MK-801可以显著抑制NMDA诱导的Ⅰ/Ⅲ型胶原含量及TTMP-1分泌的增加。单独应用MK-801与对照组比较Ⅰ型胶原含量显著降低,对Ⅲ型胶原及MMP-1/TIMP-1的正常分泌无显著影响。结论1.人胎肺成纤维细胞存在NMDA受体表达,以NR2A,NR2D表达最强。2.首次发现谷氨酸可以促进人胎肺成纤维细胞增殖。3.NMDA受体激活可以促进人胎肺成纤维细胞胶原分泌增加和自身降解的减少第四章:NMDA受体激活促进人胎肺成纤维细胞胶原和TIMP-1分泌的细胞内信号转导途径目的:研究NMDAR在人胎肺成纤维细胞胶原分泌及降解中的细胞信号转导通路,论证NMDAR在人胎肺成纤维细胞细胞外基质分泌与自身降解中的作用机制。方法1.Western Blot法观察NMDA对人胎肺成纤维细胞pERK的影响,2.ELISA法观察阻断ERK1/2磷酸化及PKC后对NMDA促人胎肺成纤维细胞Ⅰ/Ⅲ型胶原,MMP1/TIMP1释放的影响。3.定量PCR方法（Real Time PCR）检测NMDA对人胎肺成纤维细胞NMDARs mRNA表达的影响。结果1.正常人胎肺成纤维细胞存在ERK1/2磷酸化,1mM NMDA可以促进ERK1/2磷酸化增强,MK-801可以降低1mM NMDA诱导的ERK磷酸化增强。ERK磷酸化抑制剂U0126可以显著降低细胞正常ERK1/2磷酸化水平,阻断NMDA诱导的ERK1/2磷酸化增强。PKC抑制剂H7也可以显著降低细胞正常ERK1/2磷酸化水平,阻断NMDA诱导的ERK1/2磷酸化增强。2.U0126组与对照组比较Ⅰ/Ⅲ型胶原分泌显著降低,对TIMP-1、MMP-1分泌无显著影响。U0126可以显著抑制NMDA诱导的Ⅰ/Ⅲ型胶原含量及TIMP-1分泌的增加。H7组与对照组比较Ⅰ型胶原分泌显著降低,对Ⅲ型胶原含量及TIMP-1、MMP-1分泌无显著影响。H7可以显著抑制NMDA诱导的Ⅰ/Ⅲ型胶原含量及TIMP-1分泌的增加。3.1mM NMDA作用372小时后,NR1 mRNA表达无显著改变。NR2D mRNA对表达显著增强六倍以上,NR2B/NR2C mRNA表达也较对照组显著增强。NR2A mRNA表达显著下降。结论1.NMDA可以通过NMDA受体介导ERK1/2磷酸化影响人胎肺成纤维细胞胶原的分泌与自身降解。2.NMDAR-PKC-ERR1/2途径是NMDA促人胎肺成纤维细胞胶原分泌与降解的细胞信号转导通路之一。3.NMDA可以引起人胎肺成纤维细胞NMDA受体各亚基表达改变,其生物学意义有待进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 缩略语表
• 正文
• 前言
• 第一章:不同高氧暴露时间对新生大鼠的影响
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 实验分组与技术路线
• 1.4 结果
• 1.5 讨论
• 1.6 结论
• 第二章:高氧不同阶段应用MK-801对3天高氧暴露所致新生大鼠肺泡发育受阻及胶原沉积的影响
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 实验分组与技术路线
• 2.4 结果
• 2.5 讨论
• 2.6 结论
• 第三章:NMDA受体的激活对人胎肺成纤维细胞胶原分泌和自身降解的影响
• 3.1 实验材料
• 3.2 试验方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 结论
• 第四章:NMDA受体激活促进人胎肺成纤维细胞胶原和TIMP-1分泌的细胞内信号转导途径
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 4.5 结论
• 参考文献
• 附图
• 综述
• 致谢
• 在校期间发表得论文