极端嗜热菌金属蛋白酶TTHA1264，TTHA1265复合体的晶体结构研究

论文摘要

极端嗜热菌T. thermophilus是从温泉中发现的一类耐高温的真细菌,蛋白酶TTHA1264和TTHA1265是极端嗜热菌T. thermophilus HB8中两个相连的基因编码的金属蛋白水解酶,属于M16金属蛋白酶家族M16B亚家族,分别为有活性的p亚基和无活性的α亚基。以前的研究表明,M16B金属蛋白酶亚家族都是以异源二聚体的形式存在的,因此我们推测蛋白酶TTHA1264和TTHA1265在体内是以异源二聚体的形式发挥其功能的。蛋白酶TTHA1264的晶体结构已有报导,它是以同源二聚体的形式存在的,并且具有Zn2+的结合位点,但没有Zn2+结合在活性中心。本实验以极端嗜热菌T. thermophilus HB8基因组DNA为模板,PCR扩增出TTHA1264和TTHA1265共表达基因,克隆至表达载体后,在大肠杆菌中进行了异源表达,并对表达产物进行了纯化,结果只纯化得到了TTHA1265蛋白。因此我们还通过重叠PCR的方法在两个基因之间引入大肠杆菌偏好的核糖体结合位点之后,将它们在大肠杆菌中进行了异源共表达及纯化,结果还是只纯化得到了TTHA1265蛋白。由于共表达未能得到TTHA1264, TTHA1265复合体蛋白,因此我们将TTHA1264和TTHA1265分别在大肠杆菌中进行了异源表达及纯化,最终得到了目的蛋白TTHA1264和TTHA1265.对其特性的研究表明蛋白酶TTHA1264和TTHA1265能够切割结核分枝杆菌中的SigH蛋白。蛋白酶TTHA1264和TTHA1265在体外形成复合体的实验结果表明,蛋白酶TTHA1264和TTHA1265在体外能够形成复合体。运用传统的气象扩散法获得了蛋白酶TTHA1264和TTHA1265复合体的晶体以及TTHA1265蛋白的晶体,并分别收集到2.6A和2.0A的衍射数据。但是由于TTHA1265与同源蛋白的同源性较低,无法用已有的同源蛋白结构解析其三维结构。由于没有TTHA1265的晶体结构,尽管TTHA1264的结构已知,复合体蛋白的结构也无法通过分子置换获得解析。因此,为了解析TTHA1264, TTHA1265的复合体结构,我们首先制备了TTHA1265硒代甲硫氨酸衍生蛋白晶体,并收集了衍射数据,运用Se-SAD的方法解析了TTHA1265的晶体结构, TTHA1265也是以同源二聚体的形式存在的。在解析了TTHA1265的晶体结构后,运用已知结构的TTHA1264和TTHA1265为模板,采用分子置换方法,成功地解析了蛋白酶TTHA1264和TTHA1265复合体的晶体结构。从晶体结构可以看出,不同于单独结晶的TTHA1264和TTHA1265,复合体蛋白形成一种椭球形的紧密结合的异源二聚体。每个TTHA1264的催化中心含有一个锌离子。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 引言
• 文献综述
• 1. 蛋白酶研究概况
• 1.1 蛋白酶的分类
• 1.2 蛋白酶的应用
• 2. M16家族蛋白酶简介
• 3. 极端嗜热菌T. thermophilus
• 3.1 极端嗜热菌T. thermophilus简介
• 3.2 T. thermophilus HB8中的金属蛋白酶的TTHA1264和TTHA1265
• 4. 蛋白质晶体学简介
• 4.1 常用蛋白质结晶方法
• 4.2 影响蛋白质晶体生长的因素
• 第一章 极端嗜热菌蛋白水解酶TTHA1264和TTHA1265基因的克隆、体外表达、表达产物的纯化及蛋白酶功能的初步研究
• 摘要
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 质粒及宿主菌
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 T.thermophilus HB8基因组DNA
• 1.1.4 酶和试剂
• 1.1.5 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 TTHA1264和TTHA1265基因编码蛋白质的序列分析
• 1.2.2 TTHA1264和TTHA1265基因原核重组共表达质粒的构建及表达蛋白的纯化
• 1.2.3 TTHA1264和TTHA1265基因原核重组共表达质粒（引入核糖体结合位点）的构建及表达蛋白的纯化
• 1.2.4 TTHA1264和TTHA1265基因原核重组表达质粒的分别构建及表达蛋白的纯化
• 1.2.5 TTHA1264和TTHA1265蛋白功能的初步研究
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 TTHA1264和TTHA1265基因所编码蛋白的结构特征分析
• 1.3.2 TTHA1264和TTHA1265基因原核重组共表达质粒的构建及表达蛋白的纯化
• 1.3.3 TTHA1264和TTHA1265基因原核重组共表达质粒（引入适合在大肠杆菌中表达的核糖体结合位点）的构建及表达蛋白的纯化
• 1.3.4 单独表达TTHA1264和TTHA1265基因的原核重组表达质粒的构建及表达蛋白的纯化
• 1.3.5 TTHA1264和TTHA1265蛋白功能的初步研究
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第二章 极端嗜热菌TTHA1264和TTHA1265复合体的制备及复合体晶体结构的解析
• 摘要
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 表达宿主菌
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 蛋白酶TTHA1264、TTHA1265复合体的制备与纯化
• 2.2.2 蛋白质含量的测定
• 2.2.3 TTHA1264、TTHA1265蛋白的大量纯化
• 2.2.4 复合体蛋白和TTHA1265的结晶条件初筛及优化
• 2.2.5 复合体蛋白和TTHA1265蛋白晶体衍射数据采集与结构解析
• 2.2.6 TTHA1265硒代甲硫氨酸蛋白纯化结晶、数据收集及结构解析
• 2.2.7 TTHA1265和TTHA1264复合体蛋白的结构解析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 蛋白酶TTHA1264、TTHA1265复合物的鉴定与纯化
• 2.3.2 TTHA1264、1265蛋白的大量纯化
• 2.3.3 复合体TTHA（1264+1265）的分子筛纯化
• 2.3.4 复合体蛋白和TTHA1265结晶条件的筛选与优化
• 2.3.5 复合体蛋白和TTHA1265蛋白晶体的衍射、数据收集与处理
• 2.3.6 TTHA1265硒代甲硫氨酸蛋白纯化结晶及晶体的X射线衍射
• 2.3.7 TTHA1265以及TTHA1264、TTHA1265复合体结构的解析
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢