论文摘要
背景与目的：肺癌是现今社会人类常见的恶性肿瘤之一，它在全世界各类癌症中死亡率是最高的。肺癌可分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）两种类群，其中非小细胞肺癌大约占肺癌的85％，小细胞肺癌约占15％。由于有效的早期诊断技术和治疗措施的缺乏，非小细胞肺癌通常在晚期才被诊断，预后较差。因此，为了预防和治疗肺癌而对NSCLC致病机制进行深入的研究是非常重要的。TGF-β信号通路在肿瘤的发生发展进程中发挥重要的作用。RNF111基因编码的蛋白Arkadia可以通过降解TGF-β信号通路中的负调控因子Smad7, SnoN和Ski来增强TGF-β信号通路。DNA的甲基化被认为是最典型导致基因表达或者沉默的表观机制，并且与肺癌的发生发展密切相关。本研究中，我们研究RNF111基因在非小细胞肺癌和人支气管上皮细胞株中mRNA表达水平，并研究不同细胞株中mRNA表达水平的差异是基因突变还是基因启动子区甲基化导致的，为NSCLC的早期诊断和治疗提供新颖的理论依据。方法：利用实时荧光定量PCR （Real-Time PCR）检测3株细胞株（HBE、95C和95D）中RNF111基因mRNA表达水平；并用SSCP （Single StrandConformation Polymorphism）的方法检测RNF111基因启动子区和编码蛋白功能区的基因突变情况；同时利用BSP和克隆测序的方法分析95C和95D细胞株中RNF111基因启动子区CpG位点的甲基化状态，并对两株细胞株中甲基化状态有显著差异的CpG位点的甲基化频率进行计算，统计这些CpG位点甲基化频率的差异是否与其mRNA表达水平的差异相关；另外，利用EMSA（electrophoretic mobilityshift assay）实验技术，验证甲基化频率有差异的CpG位点是否是通过与特定转录因子的结合来影响RNF111基因的mRNA表达水平。结果：实时定量PCR的结果显示在三株细胞株中RNF111基因的mRNA表达水平在95C和95D之间的差异最为显著并具有统计学意义（P<0.01），暗示该基因可能与肿瘤的恶性转移程度相关。SSCP结果显示，在非小细胞肺癌组织和相应的癌旁组织以及三株细胞株中RNF111基因的启动子区和功能区均无突变发生，说明该基因mRNA表达水平的差异不是由基因突变引起的；BSP和克隆测序的结果显示，在基因启动子区的-309、-109和+3位置的CpG位点甲基化频率在95C和95D两株细胞株中有显著差异。-309位置的CpG位点甲基化的频率在95C和95D细胞株中分别是0%和40%；-109位置的CpG位点甲基化的频率分别是45%和0%；+3位置的CpG位点甲基化的频率分别是35%和5%，差异显著并且具有统计学意义（P<0.01）。说明RNF111基因启动子区的-309、-109和+3位置的CpG位点甲基化状态可能调控该基因的转录水平，导致两株细胞株之间mRNA表达水平的差异。EMSA结果显示，针对-309、-109和+3位置的CpG位点设计的探针均可以与核蛋白结合，且只有针对-309位置CpG位点设计的未甲基化和甲基化的探针结合蛋白的量存在差异，暗示该位点可能是影响基因转录的重要原因。结论：我们的研究发现RNF111基因的mRNA在95D细胞株中表达量最高且与95C存在显著差异，说明该基因可能与肺癌恶性转移有关。SSCP结果显示该表达量的变化不是由基因突变引起的。BSP和克隆测序结果表明该基因启动子区-309、-109和+3位置的CpG位点甲基化状态在两株细胞中有显著差异。EMSA实验也验证这些位点均可以与核蛋白结合，并且-309位置的CpG位点未甲基化与甲基化时结合的蛋白量存在差异，说明该位点甲基化状态可能是影响基因转录的重要原因。该位点的结合蛋白可能是负向调控转录因子，由于95D细胞株该位点的甲基化而降低负向调控转录因子的结合，导致mRNA表达量升高。至于该结合蛋白是否是转录因子，接下来还需要通过打质谱来证明。RNF111基因启动子区-309位点的甲基化状态与mRNA水平密切相关，这为NSCLC的早期诊断和抗肿瘤药物的研发提供新的靶点。