用嗜盐菌制备视紫红质和分离检测不饱和脂肪酸

论文摘要

本文对制备细菌视紫红质的嗜盐菌的培养条件，细菌视紫红质的制备过程和不饱和脂肪酸的提取进行了研究。细菌视紫红质，是存在于嗜盐菌紫膜上的跨膜蛋白质，也是一种独特的光敏蛋白质，通过光驱动质子泵效应实现光能—生物化学能量转换，对外界环境具有很强的适应性，因此成为生物光学材料性质研究、器件开发利用的热点。嗜盐菌作为一种能在高盐浓度下生长的古细菌，它的生活环境和海洋鱼类及藻类相似，由于海洋中的鱼类和藻类体内含有丰富的不饱和脂肪酸，所以推测这种菌也能合成不饱和脂肪酸。通过考察不同的培养时间、培养基的组成对菌体密度的影响得出了优化的嗜盐菌发酵条件：盐生盐杆菌发酵7天后进入稳定期，因此，发酵7天后终止发酵；培养基组成为酸水解酪蛋白胨10.00g·g-1，酵母浸膏10.00g·L-1，MgSO4·7H2O 20.00g·L-1，柠檬酸三钠3.00g·L-1，KCl 2.00 g·L-1，FeSO4·7H2O 0.05 g·L-1和NaCl 200.00 g·L-1。在复合培养基中对嗜盐菌盐生盐杆菌进行培养，当菌体浓度OD600值达到1.7以上时，停止发酵。用离心机以3 000 rpm的速度将培养成熟的发酵液离心，时间为15 min。将细胞沉淀用15倍于细胞湿重质量的去离子水重悬于烧杯中，再用超声波破碎细胞。然后8 000 rpm离心10 min。取上清液继续以12 000 rpm离心30 min，此时弃上清液，留紫红色沉淀。此两步弃的沉淀和上清液可以用来分离不饱和脂肪酸。用水洗涤沉淀，需充分震荡后再用12 000 rpm离心30 min。如此重复离心洗涤直到上清无色后，收集沉淀准备进一步纯化。最后分别配制60％，43％，35％不同浓度的蔗糖溶液，用蔗糖密度梯度法对细菌视紫红质进行纯化分离，纯化样品浓度可达到90％。收集细菌视紫红质分离过程中的上清液和沉淀物，对他们进行皂化然后萃取用以分离得到粗脂肪酸。将收集的物料转移至烧瓶中，加入KOH调pH值为12，并在80℃下恒温搅拌60 min进行皂化反应。皂化溶液冷却到室温后，再过滤除去不溶物。滤液用盐酸调至pH=2，然后2倍体积加入50％的氯仿甲醇溶液萃取脂肪酸。溶液逐渐分成两项，上相为甲醇—水相，下相为含脂肪混合物的氯仿相，流出氯仿相备用。共萃取两次。合并两次萃取液40℃下，减压蒸馏，即得混合脂肪酸浅黄色油滴。再用丙酮低温结晶法在-16℃处理除去饱和脂肪酸。用气相色谱对样品进行成分测定。结果表明盐生盐杆菌可以合成出多种不饱和脂肪酸，尤其有3种重要的不饱和脂肪酸：花生四烯酸，EPA和DHA，含量分别为1.12％，16.76％和9.38％。实验结果证明在制备细菌视紫红质的废料中可以提取不饱和脂肪酸，这扩大了嗜盐菌的应用范围。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 嗜盐菌中细菌视紫红质的功能及其分离
• 1.1.1 嗜盐菌的种类及嗜盐机理
• 1.1.2 细菌视紫红质的功能
• 1.1.3 细菌视紫红质的分离方法
• 1.1.4 嗜盐菌光敏蛋白提纯的困难
• 1.2 不饱和脂肪酸的功能及其生产富集
• 1.2.1 不饱和脂肪酸的功能
• 1.2.2 不饱和脂肪酸的生产
• 1.2.3 多价不饱和脂肪酸的提取和富集
• 1.2.4 多不饱和脂肪酸的保护与安全性
• 第二章 盐生盐杆菌发酵条件的研究
• 2.1 引言
• 2.2 试验材料与仪器
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.3 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 菌种活化
• 2.3.2 种子液的培养
• 2.3.3 发酵培养
• 2.3.4 初始菌株和活化菌株生长曲线的测定
• 600值的关系'>2.3.5 细胞干重与OD₆₀₀值的关系
• 2.3.6 培养基组成的影响
• 2.3.7 酸性氨基酸对菌体生长的影响
• 2.4 分析方法
• 2.4.1 菌体浓度的测定
• 2.4.2 pH值的测定
• 2.5 实验结果与分析
• 2.5.1 初始菌株和活化菌株生长曲线的测定
• 600值的关系'>2.5.2 细胞干重与OD₆₀₀值的关系
• 2.5.3 培养基组成对菌体生长的影响
• 2.5.4 酸性氨基酸对菌体生长的影响
• 2.6 本章小结
• 第三章 视紫红质蛋白的分离研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料和仪器
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验仪器
• 3.3 实验操作与方法
• 3.3.1 获取细胞
• 3.3.2 超声波破碎细胞
• 3.3.3 细菌视紫红质的初步离心分离
• 3.3.4 细菌视紫红质的纯化
• 3.4 分析方法
• 3.4.1 细菌视紫红质的鉴定SDS-PAGE凝胶电泳
• 3.4.2 紫外分光光度检测
• 3.5 实验结果与分析
• 3.5.1 溶液体积对菌体超声波破碎效果的影响
• 3.5.2 细菌视紫红质的鉴定
• 3.6 本章小结
• 第四章 不饱和脂肪酸的分离研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料和仪器
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验仪器
• 4.3 实验操作与方法
• 4.3.1 皂化反应
• 4.3.2 萃取
• 4.3.3 纯化
• 4.4 分析方法
• 4.4.1 pH值的测定
• 4.4.2 脂肪酸成分检测
• 4.5 实验结果与分析
• 4.6 本章小结
• 第五章 结论与建议
• 5.1 结论
• 5.2 建议
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 研究成果及发表的学术论文
• 作者简介
• 硕士研究生学位论文答辩委员会决议书