果蝇原多酚氧化酶原核表达及其活性检测研究

论文摘要

昆虫原多酚氧化酶（prophenoloxidase，PPO）是一个重要的天生免疫蛋白，它们的酶联激活反应已有大量文献报道，但是PPO蛋白家族的生化特性仍有许多不清楚的地方，主要原因是难以得到足够的PPO蛋白。我们在原核细胞中成功表达了果蝇的三个PPO蛋白，优化表达条件，调节了培养大肠杆菌诱导温度，明显增加了可溶性重组蛋白的表达，使这些蛋白都具有活性，这项工作为后续的实验奠定了基础。研究结果如下：1．果蝇PPO1、PPO2和PPO3都能在原核细胞中表达。37℃诱导的PPO比16℃诱导的表达量高，但主要在包涵体中表达。16℃诱导时，约有一半目的蛋白存在包涵体中，另一半以可溶性蛋白形式存在。通过Western blot检测，原核表达的PPO1和PPO3分子量大小基本上与果蝇S2细胞系表达的一致，可能是它们不需要翻译后再修饰或修饰较少；对PPO2而言，真核表达的蛋白比原核表达的略大，可能PPO2需要翻译后再修饰。2．16℃诱导的PPO活性检测。表达PPO蛋白的细菌或其细菌裂解粗提蛋白都可以用30%酒精或0.02%CPC （cetylpyridinium chloride）激活。PPO1活性最强，PPO3次之，而PPO2最低。对于PPO1和PPO3，30%酒精比0.02%CPC激活效果明显；对于PPO2，0.02%CPC比30%酒精激活效果明显。3．随诱导时间增加PPO1的表达量变化。在16℃诱导时，在最初的12h内，随着诱导时间增加，表达量也增加，第12h时表达量最高。4.30%酒精和铜离子处理先后顺序对PPO1的活性影响。结果表明：在检测PPO1的活性时，不论酒精和铜离子那种试剂先加，都可以检测到明显活性，但先加铜离子后再用酒精激活比先加酒精后加铜离子的活性高。5．纯化PPO蛋白与铜离子的剂量效应。原核表达后纯化果蝇三个PPO蛋白，当培养基或溶液中没有铜离子时，它们都没有活性。对于PPO1和PPO3，铜离子浓度在2-10μM时活性已经很高；对于PPO2，铜离子浓度至少100μM时，才有较高活性；当铜离子大于500μM时，活性开始降低；达到2000μM时，几乎没有活性或很低。本文建立的方法有利于今后对3种PPO蛋白特性和功能研究，有利于大量表达和纯化昆虫特异的重组PPO，而利用传统的蛋白纯化方法很难做到这点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 PPO 简介
• 2 多酚氧化酶的结构
• 3 PPO 的活性调控
• 4 对病原微生物的黑化反应
• 5 PPO 研究的展望
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒
• 2.1.2 菌株及细胞
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 仪器设备与酶
• 2.1.5 主要试剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒构建
• 2.2.1.1 引物设计与 PCR 扩增
• 2.2.1.2 回收 PCR 凝胶产物
• 2.2.1.3 目的基因连接到 pMD 18T 载体
• 2.2.1.4 大肠杆菌（E.coli）Top10（或 BL21）转化
• 2.2.1.5 菌落 PCR 鉴定
• 2.2.1.6 质粒抽提
• 2.2.1.7 双酶切 pMD 18T-PPO1/2/3 和 pET 28a
• 2.2.1.8 连接目的基因与表达载体
• 2.2.1.9 转化、菌落 PCR 鉴定和测序验证
• 2.2.2 原核基因诱导表达
• 2.2.2.1 目的基因快速诱导表达
• 2.2.2.2 小量蛋白诱导表达
• 2.2.2.3 大量蛋白诱导表达
• 2.2.3 Western blot 鉴定目的基因的表达
• 2.2.4 纯化目的蛋白
• 2.2.5 PPO 蛋白活性测定
• 2.2.5.1 酶活测定
• 2.2.5.2 颜色反应
• 2.2.5.3 Native gel 检测
• 2.2.6 S2 细胞培养
• 2.2.7 目的基因在 S2 细胞中的转染和表达
• 3 实验结果与分析
• 3.1 PPO1/2/3 基因的 PCR 扩增
• 3.2 PPO1/2/3 基因在 T 载体上的克隆鉴定
• 3.3 pMD 18T-PPO1/2/3 和 pET 28a 双酶切
• 3.4 His-PPO1/2/3（His-pET 28a-PPO1/2/3）菌落 PCR 鉴定
• 3.5 PPO1-His 和 His-PPO1/2/3 原核诱导表达和 Western blot 分析
• 3.6 pET 28a-PPO1-His 不同诱导时间表达量比较
• 3.7 不同条件（16℃和 37℃的原核表达和 S2 细胞真核表达）对 PPO1/2/3 表达影响的比较
• 3.8 酒精和铜的先后顺序不影响 PPO1-His 的活性
• 3.9 PPO1-His，His-PPO3 活性条件的摸索
• 3.10 原核表达后的细菌用 30%酒精和 0.02%CPC 激活后酶活比较
• 3.11 用 30%酒精激活不同条件表达 PPO（16℃和 37℃）的颜色反应
• 3.12 PPO1-His、His-PPO1/2/3 表达量的 Western blot 比较及酶活比较
• 3.13 PPO1-His，His-PPO3 Native gel 活性比较分析
• 3.14 PPO1-His、His-PPO1/2/3 纯化及与铜离子的剂量效应
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 攻读硕士期间发表论文情况