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摘要：本文对还原糖的常用分析方法进行了比较和改进，旨在选择准确度高、重复性好的分析方法测定豆浆中的还原糖。研究结果表明，3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）为检测豆浆还原糖的最佳方法；对此法进行了应用条件的改进，即按豆浆：乙酸锌：亚铁氰化钾=10：1：2的体积比对豆浆样品进行预处理，可使检测的准确度提高18%以上，用此法处理后的豆浆样品在498nm波长处有最大吸收峰测定，且检测准确度提高2%以上。
关键词：豆浆；还原糖；水杨酸比色法
引言
目前还原糖的测定方法很多，其中最常用的方法之一是费林试剂法。而在检测豆浆还原糖时，3，5-二硝基水杨酸法比费林试剂法的测定速度更快、操作更简便、精确度更高。水杨酸比色法利用3，5-二硝基水杨酸试剂在碱性条件下与还原糖共沸，使之还原成红褐色的3-氨基-5-硝基水杨酸，在一定范围内（5-100μg/mL）还原糖含量与红褐色反应液的色泽深浅成正比，通过分光光度计比色可测得样品的还原糖含量。由于豆浆中还原糖含量偏低，偏离了最佳测定范围，所以存在准确度不高、重复性差的问题。因此要取得正确可靠的数据，必须进一步选择和改进测定方法的操作条件。本文对水杨酸比色法测定豆浆还原糖的操作条件进行了系列试验，在现有方法的基础上作了有效的改进。
1材料与方法
1.1材料
黄大豆：4.5mm粒径食品豆
1.2试剂
葡萄糖、3，5-二硝基水杨酸（DNS）、氢氧化钠、酒石酸钾钠、结晶酚、无水亚硫酸钠、乙酸锌、冰乙酸、亚铁氰化钾等均为分析纯。
1.3仪器设备
豆浆机：DJ13B-N620SG型，九阳股份有限公司；UV5型紫外可见分光光度计：梅特勒-托利多国际有限公司；BS124S型电子分析天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-6型电热恒温水浴锅：金坛市科析仪器有限公司。
2试验方法
2.1豆浆的制备工艺
黄大豆→精选→清洗→浸泡→磨浆（料水比为1：16）→过滤→豆浆
2.2水杨酸比色（DNS）法的常规步骤
2.2.1样品预处理
取豆浆30mL，置于100mL容量瓶中，边摇边缓慢地加入5mL的21.9%乙酸锌以除去蛋白质等干扰成分，再加入5mL的10.6%亚铁氢化钾溶液除去多余的锌离子，加水至刻度，摇匀。静置30min后用滤纸过滤，收集滤液备用。
2.2.2葡萄糖标准曲线制作
分别取葡萄糖标准溶液（1mg/mL）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL加入已编号的试管中，用蒸馏水稀释至1mL，加入1mLDNS试剂，混匀，在沸水浴中准确加热5min后取出，快速冷却至室温，再加入蒸馏水8mL，混匀，在波长520nm下，用1cm比色杯测定各待测液的吸光度值，以葡萄糖含量为横坐标，各相应浓度样液的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
2.2.3样品还原糖测定
取经预处理后的待测液1mL于试管中，加入1mLDNS试剂，在沸水浴中准确加热5min后取出，快速冷却至室温，再加入蒸馏水8mL，混匀，在波长520nm下测定吸光度。通过标准曲线计算出样品的还原糖含量。
2.3DNS法的操作条件研究
2.3.1预处理条件对样品吸光度的影响
在进行豆浆样品预处理时，改变亚铁氢化钾溶液的用量，测定反应液吸光度，探讨不同的亚铁氢化钾添加量对测定结果的影响。
2.3.2最佳测定波长的确定
用分光光度计测定一定浓度的葡萄糖标准溶液在不同波长下的吸光度，以确定具有最大吸收峰的波长。
2.3.3显色时间的确定
准确吸取0.3mg/mL的葡萄糖溶液或豆浆处理液1mL于具塞试管中，加入1mLDNS试剂，混匀，在沸水浴中分别加热1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30min后取出，快速冷却至室温，再加入蒸馏水8mL，混匀，测定吸光度。比较不同显色时间下的吸光度，确定最佳显色时间。
2.3.4回收率的测定
采用标准加入法，在已知还原糖含量的豆浆中，精密加入不同量的葡萄糖标准液，测定还原糖含量，按下式计算DDS法的测定回收率。
回收率（%）=（加葡萄糖后豆浆总还原糖量-原豆浆的还原糖量）/加入的葡萄糖量×100%
3结果与分析
3.1水杨酸比色法测定条件研究
3.1.1样品预处理条件对吸光度测定值的影响
由于豆浆中的还原糖含量较低，在预处理时必须增加样液量以保证测定的准确度，因此分别取50mL豆浆样液，加入5mL21.9%乙酸锌，再加入不同量的10.6%亚铁氢化钾，定容过滤后各取1mL处理液进行DNS反应，于520nm波长处测定吸光度。根据实验结果，亚铁氰化钾的添加量为9～11mL时，吸光值的波动最小，因此在本试验体系下，应添加10.9%亚铁氰化钾10mL，即按豆浆：乙酸锌：亚铁氰化钾=10：1：2进行预处理。
3.1.2最佳测定波长的确定
在进行比色分析时，选择最大光吸收波长作为测定波长可增加检测的灵敏度。在不同波长下测定了同一浓度样液的吸光度，检测显示最大吸收值在498nm处。
在实际操作中，因样品和仪器的不同，最大光吸收波长会有差异。在498、520、540nm波长下测定了葡萄糖的标准曲线，结果见图1。
图1不同波长下的标准曲线
由图3可知，不同波长下的葡萄糖标准曲线确实存在着差异性，在糖液浓度较低时，标线之间差异小，但当糖液浓度增高时，标线差异增大。当糖浓度为0.4mg/mL时，498与520、549nm的吸光度测定值相对误差分别为18.28%和24.11%；在糖浓度大于0.4mg/mL后，520、540nm的标线出现偏移，线性已受到影响。对图3标准曲线进行了回归，在波长498nm下，吸光度测定值的回归曲线的相关系数R2为0.9999，最接近1，线性最好。因此498nm可作为测定豆浆还原糖的最佳波长。
3.1.3显色时间的确定
取标准葡萄糖溶液和豆浆处理液进行不同时间的DNS反应后，测定吸光度，比较不同时间的测定值差异，以确定最佳显色时间。显色反应5min后，标样和豆浆样的DNS反应已基本完成，所测得的吸光度已趋于稳定，因此最佳的显色反应时间保持不变，仍为5min。
3.2回收率测定与比较
当豆浆含糖量较大时，不同波长下的测定值在5%水平上有显著性差异，而498nm和540nm之间无显著性差异；当豆浆含糖量低时，三种波长的测定值之间均无显著性差异。因此对普通的豆浆进行还原糖测定时，以498nm为吸光度测定波长比520nm更合适。
4结论
通过对水杨酸比色法测定豆浆中还原糖含量的影响因素进行试验、比较和筛选，确定在豆浆还原糖含量测定的样品处理时，操作条件为：豆浆样液取50mL，21.9%乙酸锌5mL，10.6%亚铁氰化钾10mL，即豆浆：乙酸锌：亚铁氰化钾=10：1：2；最佳测定吸光值的波长为498nm，最佳显色时间保持为5min。
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