旋毛虫新生幼虫脱氧核糖核酸酶Ⅱ表达及鉴定

论文摘要

对本实验室通过筛选旋毛虫新生幼虫差减cDNA 文库所获得的新生幼虫期特异性表达基因N5（基因库注册号为:AF331159）进行Interproscan 检索,发现N5 可能编码脱氧核糖核酸酶Ⅱ（DNaseⅡ）。构建原核表达载体pET28a-N5。将重组质粒pET28a-N5 放入表达菌E.coli BL21 （DE3）。用IPTG 在不同的表达条件（不同温度、IPTG 浓度、细菌的OD 值）对重组表达菌BL21 （DE3）进行诱导,对菌体裂解物进行SDS-PAGE 分析。结果显示:不同诱导条件下表达表达量不同。利用尿素提取包涵体法提取不同条件下表达的包涵体。将包涵体分别溶于TE（Triscl-EDTA）、PBS（磷酸盐缓冲液）置于4℃冰箱中复性,然后用包涵体复性后的上清液对λDNA 进行酶切分析,结果表明:复性后的包涵体上清液中的可溶蛋白具有较强的核酸酶活性。通过对N5 基因序列分析以及将N5 同其他物种的脱氧核糖核酸酶Ⅱ基因进行比对,发现N5 基因在基因水平上属于编码脱氧核糖核酸酶Ⅱ基因家族成员,并找出N5 基因编码活性中心氨基酸和中心内关键氨基酸的碱基序列,通过PCR 进行对编码关键氨基酸-组氨酸的密码子分别定点突变为编码赖氨酸和丝氨酸的密码子（突变后的基因分别命名为MC578A-29、MC578B-29）。突变后,同样构建原核表达载体pET28a-MC578A-29、pET28a-MC578B-29,进行诱导表达和酶活性测定,发现突变后所编码的蛋白通过溶于PBS,4℃进行复性,复性后上清液中的可溶蛋白核酸酶活性明显下降或丧失。说明:活性中心的分析和定点突变位置的选择是正确的。对N5 和MC578A-29、MC578B-29 表达产物在不同条件进行酶活分析,证明该N5 基因编码的脱氧核糖核酸酶具有DNaseII 的特性。DNaseⅡ的作用特性:1 最佳pH 条件为酸性;2 不依赖二价阳离子;3

论文目录

• 第一篇 文献综述
• 1 酶活研究的方法介绍
• 1.1 几种不同类型的诱变方法
• 1.2 ATA 在生物学研究中的应用
• 2 脱氧核糖核酸酶Ⅱ的研究进展
• 2.1 糖核酸酶Ⅱ的特性
• 2.2 有关DNaseⅡ基因研究进展
• 2.3 功能特性
• 第二篇 实验内容
• 第一章 旋毛虫新生幼虫期脱氧核糖核酸酶Ⅱ基因序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 序列测定及分析
• 2 结果
• 2.1 测序结果
• 2.2 分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二章 脱氧核糖核酸酶II的表达及鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 脱氧核糖核酸酶II 活性中心的鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 中文摘要
• Abstract
• 致谢
• 导师简历
• 个人简历