论文摘要
以黄肉型中华猕猴桃（Actinidia chinensis Planch）‘金丰’为实验材料,对有机溶剂微波法萃取果实中类胡萝卜素的方法以及果肉总RNA提取方法的比较进行研究；并以绿肉猕猴桃为对照,进行果肉色差、叶绿素、类胡萝卜素、类胡萝卜素／叶绿素（比值）、类黄酮、花青苷、糖、酸等生理指标的测定及各生理指标间相关性分析；通过转录组测序技术对黄肉猕猴桃‘金丰’的转录组进行测序并结合Illimina/Hisseq测序技术构建了‘金丰’猕猴桃3个不同转色时期果肉的数字基因表达谱（Digital Gene Expression, DGE）文库,同时对其果实着色过程中相关差异基因的表达进行了解析,可为分析黄肉猕猴桃‘金丰’在果实发育过程中色泽的变化规律,寻找调控黄肉猕猴桃果实呈色的潜在关键基因,以及探讨猕猴桃果肉呈色机理奠定理论基础。主要研究结果如下：1)研究了有机溶剂微波法萃取中华猕猴桃果实中的类胡萝卜素。单因素实验结果表明,微波萃取中华猕猴桃色素的最佳单因素依次为乙醇-丙酮体积分数=2：1的混合溶剂,微波火力中高火（720W）,萃取时间20s,料液比为1：6。正交实验结果表明,用乙醇-丙酮体积分数=2：1的混合溶剂浸提,料液比为1：6,在微波火力中高火下萃取25s的提取效果最好。2)为分析黄肉猕猴桃‘金丰’在果实发育过程中色泽的变化,以‘金丰’（黄肉）和‘金魁’（绿肉）为材料,进行果肉色差、叶绿素、类胡萝卜素、类胡萝卜素／叶绿素（比值）、类黄酮、花青苷、糖、酸等生理指标的测定及各生理指标间相关性分析,结果表明：‘金丰’和‘金魁’在果实发育过程中类胡萝卜素与叶绿素的比值、糖、酸与果肉色差呈显著或极显著负相关性,根据‘金丰’叶绿素a、叶绿素b下降幅度大于‘金魁’,两者类胡萝卜素成熟期与初果期无显著差异表明叶绿素下降以及类胡萝卜素保持较为稳定的含量为‘金丰’果肉呈现黄色的重要因素；类黄酮与果肉色差呈显著或极显著正相关,‘金丰’类黄酮的含量一直大于‘金魁’,因此类黄酮的较高含量也为‘金丰’果肉呈现黄色的又一重要因素；此外,类黄酮与糖、酸呈显著或极显著负相关,这表明‘金丰’较高的糖酸含量可能具有维持类黄酮较高含量的功能,从而达到影响果肉色泽的效果。据此,‘金丰’猕猴桃果实发育过程中叶绿素的降解、稳定的类胡萝卜素以及较高含量的类黄酮和糖、酸含量可能是其果肉呈现黄色的重要因素。3)通过吸光比值分析、琼脂糖凝胶电泳实验以及反转录实验比较异硫氰酸胍法、市售经典总RNA抽提试剂盒以及改良CTAB法提取黄肉猕猴桃果肉总RNA的可行性。结果表明,改良CTAB法提取的猕猴桃果肉总RNA效果较好,其RNA吸光比值A260/A230为1.4-1.9,A260/A280在1.7-1.9之间。琼脂糖凝胶电泳结果以及RT-PCR结果显示,改良CTAB法提取的猕猴桃果肉总RNA能满足后续的分子生物学研究。4)以中华猕猴桃黄肉品种‘金丰’为试材,利用Illimina/Hisseq测序技术构建其果实发育中3个不同转色期DGE文库,以转录组数据为参考数据库,进行GO功能富集以及Pathway功能富集分析。结果表明,转录组经组装分析获得47,233条unigene,平均长度739bp。基于六个数据库（NR, NT, SwissProt, KEGG, COG和GO）用Blastx进行相似性比对,分别有34,313、30,203、20,921、18,961、11,660和13,905个转录本被注释或分类,COG分类揭示有1117个转录本的功能目前尚未被报道。DGE文库构建转色前期、转色期和成熟期分别获得4,724,009,4,565,159和4,626,730个标签。转色期与转色前期之间差异表达基因的个数为2641个,成熟期与转色前期有差异表达的基因个数是2671,成熟期与转色期之间有1457个基因有表达差异。通过GO功能富集及Pathway功能富集分析,分别获得了102条叶绿素Unigenes与111条类胡萝卜素Unigenes,其中12条叶绿素Unigenes及14条类胡萝卜素Unigenes在果实的三个不同转色期有显著差异表达（P<0.05）。黄肉猕猴桃呈色的关键基因可能存在于具有显著差异表达的12条调控叶绿素合成以及14条调控类胡萝卜素合成的Unigenes之中。