丹参道地药材cDNA芯片构建及毛状根基因表达谱研究

论文摘要

丹参Salvia milltiorrhiza Bge.为我国传统名贵中药材,具有活血化瘀,通经止痛的功效。丹参中主要含有脂溶性二萜醌类化合物和水溶性化合物,其中以丹参酮ⅡA为代表的二萜醌类化合物是治疗心脑血管系统疾病的重要药物。丹参种质层次不齐,不同产地质量差异悬殊,急需利用现代生物技术和分子生物学研究手段寻找次生代谢关键酶基因,明确影响其含量的关键因素,为培育优良种质、提高组织培养和转基因丹参中目的产物含量提供基础。道地药材是中药材质量控制的一项独具特色的综合判断标准,为从基因水平阐释道地药材的形成机理,大规模寻找功能基因,本论文制作了首张道地药材基因芯片,并对不同时期毛状根进行基因表达谱研究,得到一批与次生代谢有关的基因,为丹参功能基因组学和道地药材形成机理研究探索了新的思路和方法。 主要研究结果如下: 1.构建了道地产区丹参根的cDNA噬菌体文库,库容为3×105,插入片段500～2500bp。 2.制作了包含4354个克隆的丹参cDNA芯片,它是首张有关道地药材的芯片。 3.得到114个在毛状根不同时期差异表达的独立基因（Unigene）。52个为丹参中首次报道。 4.利用NCBI的BLASTX和BLASTN工具对差异基因进行功能注释,有92.10%的基因得到注释。 5.67个基因得到“GO”注释,分别归入细胞组成、分子功能和生物过程三个分支。 6.26个基因涉及29个代谢相关的酶在KEGG“PATHWAY”中得到注释,参与碳水化合物代谢、次生代谢和氨基酸代谢的最多。 7.通过Northern点杂交检验5个基因在60天和30天材料中的表达情况,结果与芯片杂交结果完全一致。 8.首次得到1个丹参二萜生物合成基因的cDNA片段,copalyl diphosphate synthase（CPS）。序列长度为1479bp,编码418个氨基酸,为C末端。具有TerpenecyclaseplantC1保守区,为丹参酮类合成中的关键酶基因。 9.得到8个P450基因cDNA片段,4个为首次报道。 10.首次从丹参中克隆8个基因全长序列。分别为2个Aldo-keto reductase家族基因,2

论文目录

• 第1章 文献综述
• 1.1 丹参次生代谢产物及分子生物学研究进展
• 1.2 表达序列标签（EST）技术简介
• 1.3 基因芯片技术简介
• 1.4 本课题研究的意义
• 第2章 材料和方法（汇总）
• 2.1 实验材料
• 2.2 RNA提取
• 2.3 cDNA文库的构建
• 2.4 噬菌体文库操作
• 2.5 探针制备和纯化
• 2.6 DNA芯片点制
• 2.7 DNA芯片探针标记、杂交和扫描
• 2.8 芯片结果分析
• 2.9 次生代谢产物分析
• 第3章 丹参cDNA芯片的制作
• 3.1 总 RNA提取方法的建立
• 3.2 cDNA文库建立和质量鉴定
• 3.3 cDNA芯片探针的制备
• 3.4 芯片点制
• 3.5 讨论
• 第4章 丹参毛状根不同时期表达谱研究
• 4.1 芯片实验设计
• 4.2 生长量和次生代谢产物分析
• 4.3 cDNA芯片杂交
• 4.4 差异基因生物信息学分析
• 4.5 Northem点杂交验证
• 4.6 小结
• 4.7 讨论
• 第五章 丹参相关基因的序列分析
• 5.1 丹参二菇生物合成基因分析
• 5.2 丹参 P450基因分析
• 5.3 丹参 AKR基因序列分析
• 5.4 丹参水解酶基因序列分析
• 5.5 丹参 TCTP基因序列分析
• 5.6 丹参金属硫蛋白（MT-2）基因的序列分析
• 5.7 丹参 GLP基因序列分析
• 5.8 丹参 EREBP基因序列分析
• 第6章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历