凉血化瘀方对缺氧状态下人视网膜色素上皮细胞增生及VEGF表达的研究

论文摘要

目的：通过建立体外培养的人视网膜色素上皮细胞模型，观察缺氧对该细胞的影响；采用唐由之研究员经验方凉血化瘀方作为干预药物，观察不同浓度的凉血化瘀方中药及服用了不同剂量凉血化瘀方中药的大鼠血清对缺氧状态下人视网膜色素上皮细胞增生及VEGF表达的影响。从分子生物学及血清药理学的角度探讨年龄相关性黄斑变性中药治疗的疗效机制，为中医中药治疗年龄相关性黄斑变性提供实验依据。方法：1、用胰酶消化法分离、培养人视网膜色素上皮细胞，免疫细胞化学法对其进行鉴定。观察细胞的生长过程及冻存、复苏状况。2、用CoCl2建立细胞化学缺氧模型，采用MTT法及WST—8法观察缺氧对人视网膜色素上皮细胞增生的影响。3．WST—8法观察不同浓度凉血化瘀方中药和服用了不同剂量凉血化瘀方中药的大鼠血清对缺氧状态下人视网膜色素上皮细胞增生的影响。4．采用ELISA法检测不同浓度凉血化瘀方中药和服用了不同剂量凉血化瘀方中药的大鼠血清对缺氧状态下人视网膜色素上皮细胞培养上清VEGF含量的影响。结果：1、在原代细胞培养中，新鲜分离的RPE原代细胞在体外1～3d即可贴壁伸展，7～8d后，逐渐出现细胞集落，10～12d大部分培养瓶底部细胞呈融合状态。随着传代次数增加，胞浆内的黑色素颗粒逐渐减少直至消失，细胞形态呈梭形或不规则形，类似成纤维细胞。复苏细胞的存活率可达90％以上，相差倒置显微镜下观察发现细胞形态与冻存前相比无明显差异。免疫细胞化学鉴定，CK阳性，S100阳性。2、用CoCl2建立RPE细胞化学缺氧模型，采用MTT法和WST—8法检测细胞活性，结果显示：终浓度为1mMol／L CoCl2浓度过高，影响细胞活性，抑制细胞增殖。终浓度为1uMol／L、10uMol／L、100uMol／L CoCl2培养的RPE细胞均明显增殖，具有统计学差异，且其增生程度呈浓度依赖性，其中终浓度为100uMol／L COCl2培养的RPE细胞增殖最明显，P＜0.01。3、观察凉血化瘀方中药对RPE细胞的影响，结果显示：终浓度为20mg／ml以上的凉血化瘀方中药影响RPE细胞的活性。4、采用凉血化瘀方中药观察其对缺氧状态下人RPE细胞增殖的影响，结果显示：终浓度为2mg／ml、200ug／ml的中药抑制了缺氧状态下人RPE细胞的增殖，且高浓度比低浓度更能明显抑制人RPE细胞的增殖，P＜0.01。5、观察服用了不同剂量凉血化瘀方中药的大鼠血清对缺氧状态下人视网膜色素上皮细胞增生的影响，结果显示：缺氧条件下，10％、20％、40％大剂量含中药鼠血清及20％中剂量含中药鼠血清均抑制了缺氧状态下人RPE细胞的增生，且其抑制程度呈浓度依赖性。6、用ELISA法检测不同浓度的凉血化瘀方中药对缺氧状态下人视网膜色素上皮细胞培养上清VEGF含量的影响，发现加入终浓度为2ug／ml、20ug／ml、200ug／ml和2mg／ml的凉血化瘀方中药均降低了缺氧状态下RPE细胞培养上清中VEGF的含量，具有统计学显著差异，P＜0.01。同时检测服用了不同剂量凉血化瘀方中药的大鼠血清对缺氧状态下人视网膜色素上皮细胞培养上清VEGF含量的影响，发现缺氧条件下，5％中、大剂量含中药鼠血清及10％、20％、40％各组剂量含中药血清培养的人RPE细胞上清中VEGF含量均明显降低，有统计学显著差异，P＜0.01。结论：1．正常人RPE细胞的体外培养、冻存及复苏模式的建立，可为研究与RPE相关的眼底疾病的发病机制提供较好的体外细胞模型。2．缺氧能引起RPE细胞显著增殖。用WST—8法检测细胞活性的方法较MTT法更优越。3．缺氧能明显引起RPE细胞VEGF表达增加。4．中药凉血化瘀方能抑制缺氧状态下人RPE细胞的增生及VEGF的表达，可能是其临床治疗年龄相关性黄斑变性有效的机制之一，为该方抑制CNV形成提供了实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略语
• 综述: 年龄相关性黄斑变性研究现状
• 前言
• 第一部分 人视网膜色素上皮细胞的培养与鉴定
• 材料和方法
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 仪器设备
• 2 方法
• 2.1 人 RPE 细胞的培养、冻存与复苏
• 2.2 人 RPE 细胞的鉴定
• 结果
• 讨论
• 第二部分 RPE 细胞化学缺氧模型的建立及缺氧对 RPE 细胞增生的影响
• 材料和方法
• 1 材料
• 1.1 实验细胞
• 1.2 主要试剂
• 1.3 仪器设备
• 2 方法
• 2.1 RPE 细胞化学缺氧模型的建立
• 2.2 MTT法检测缺氧对体外培养的人 RPE 细胞增生的影响
• 2.3 WST-8 法检测缺氧对体外培养的人 RPE 细胞增生的影响
• 结果
• 讨论
• 第三部分 凉血化瘀方对缺氧状态下人 RPE 细胞增生的影响
• 材料和方法
• 1 材料
• 1.1 中药制备
• 1.2 细胞
• 1.3 实验动物
• 1.4 主要试剂和仪器
• 2 方法
• 2.1 大鼠含中药血清的制备
• 2.2 RPE细胞化学缺氧模型的建立
• 2.3 中药凉血化瘀方对 RPE 细胞的影响
• 2.4 中药凉血化瘀方对缺氧状态下 RPE 细胞增生的影响
• 2.5 含中药血清对缺氧状态下 RPE 细胞增生的影响
• 结果
• 讨论
• 第四部分 凉血化瘀方对缺氧状态下 RPE 细胞 VEGF 表达的影响
• 材料和方法
• 1 材料
• 1.1 实验细胞
• 1.2 主要试剂
• 1.3 仪器设备
• 2 方法
• 2.1 RPE 细胞化学缺氧模型的建立
• 2.2 缺氧对 RPE 细胞 VEGF 表达的影响
• 2.3 中药凉血化瘀方对缺氧状态下 RPE 细胞 VEGF 表达的影响
• 2.4 含中药血清对缺氧状态下 RPE 细胞 VEGF 表达的影响
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历