花生种子特异表达载体构建与农杆菌介导基因转化技术体系的优化

论文摘要

花生是世界范围内广泛栽培的油料与经济作物,是全球四大油料作物之一,也是我国单产、总产和出口创汇额最高的油料作物。利用转基因技术改良花生籽仁品质是花生分子育种研究的重要领域。本研究采用同源克隆技术从花生栽培品种丰花3号基因组中分离获得了两个种子特异表达启动子,并构建成了种子特异表达载体;研究了基因型、芽丛诱导培养基和芽丛成苗培养基三个因素对花生胚小叶再生效率的影响,获得了三因素最优组合的花生胚小叶离体再生体系;并对21个基因型花生进行了基因转化效率的比较研究,获得了转基因植株,PCR检测证明目的基因已整合到花生基因组中。为花生品质改良的分子育种研究奠定了基础。其主要结果如下:1花生油体蛋白Oleosin基因启动子的克隆及其种子特异表达载体的构建根据GeneBank上发表的花生Oleosin17.8基因的序列（EF695400）设计引物,用丰花3号基因组DNA为模板进行PCR扩增花生Oleosin启动子,琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增的目的片段,并与克隆载体pGM-T easy连接,获得重组质粒pT-OL1584,序列分析表明,获得的启动子序列长1584bp,与GenBank发表的Oleosin17.8启动子同源性为99.37%,除含有TATA、CAAT基本转录元件外,还有2个富含AT序列、2个RY重复序列元件、1个ACCCCA元件,2个TACACAT盒、5个CATG盒、5个E-Box、6个GATA-Box及14个DOF蛋白的AAAG基序等种子特异型启动子所具有的顺式作用元件。OL1584的GeneBank登录序列号为EU518466。重组子pT-OL1584用HindⅢ、BamHⅠ双酶切,并回收目的OL1584基因片断和切除35S启动子的pBI121载体DNA,经连接构建成种子特异表达载体pB-OL1584。并且在OL1584内部设计2个上游引物以重组质粒pT-OL1584为模板,进行PCR扩增,获得含Oleosin启动子5’端缺失片段的重组子pT-OL755和pT-OL375。2.花生致敏蛋白基因Ara h1启动子的克隆及其种子特异表达载体的构建参考王静（2005）和Olga M（2003）报道的花生Ara h1基因的序列设计引物,用丰花3号基因组DNA为模板进行PCR扩增花生Ara h1启动子,1.2%琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增的目的片段,并与克隆载体pGM-T easy连接,获得重组质粒pT-Ah1968,序列分析表明,Ah1968（GeneBank登录号为EU526898）启动子序列长1968bp,与王静发表的序列同源性为99.14%,与Olga M发表的序列同源性为98.27%.Ah1968除含有基本转录元件TATA、CAAT外,还含有3个AT-Rich、2个RY元件、3个CATG、1个ACCCCA、2个E-Box、2个TACACAT类似序列、2个TAACACA、10个GATA-Box和13个AAAG（DOF蛋白结合基序）等种子特异型启动子所具有的顺式作用元件。重组子pT-Ah1968和质粒pBI121分别用HindⅢ、BamHⅠ双酶切,并回收目的基因片断（约1716bp）和切除35S启动子的pBI121载体DNA,经连接构建成种子特异表达载体pB-Ah1716。在Ah1968内部设计3个上游引物以重组质粒pT-Ah1968为模板,进行PCR扩增,获得了Ara h1启动子5’端缺失片段的重组子pT-Ah1300、pT-Ah1000和pT-Ah500。3花生胚小叶离体再生技术体系的优化（1）不同品种适宜芽丛诱导培养基的筛选小花生品种丰花2号适宜的芽丛诱导培养基为MSB + 3.0mg/L BA + 0.7mg/L NAA,芽丛诱导率为81.49%,再生率为94.39%;大花生品种丰花3号适宜的芽丛诱导培养基为MSB + 4.5mg/L BA + 0.2mg/L NAA,芽丛诱导率为72.33%,再生率为10.70%。（2）不同品种适宜芽丛成苗培养基的筛选丰花2号适宜的芽丛成苗培养基为MSB+ 2.5mg/L BA,芽丛出苗率、再生率分别为:172.00%和122.10%;丰花3号适宜的芽丛成苗培养基为MSB+ 5.0mg/L KIN,芽丛出苗率、再生率分别为:33.33%、4.03%。不同基因型之间的成苗芽丛百分率、芽丛出苗率和植株再生率差异显著,基因型不同是造成花生再生率差异的主要因素。以胚小叶为外植体获取较高植株再生率的三因素最佳组合为:花生品种丰花2号、芽丛诱导培养基为MSB + 3.0mg/L BA + 0.7mg/L NAA,芽丛成苗培养基为MSB+ 2.5mg/L BA。可作为花生基因转化良好的受体系统。4不同基因型花生基因转化效率的比较以花生胚小叶为外植体,用携带有γ-维生素E甲基转移酶基因（γ-tmt）和筛选标记基因bar的植物表达载体（质粒为pGBVE ,根癌农杆菌为GV3101）,对花生21个基因型进行了基因转化。结果表明:农杆菌侵染后再生率较高的10个基因型为:丰花2号、02P181、丰花3号、不结瘤系、丰花1号、白沙1016、丰花6号、05D651、海花1号、蓬莱一窝猴;基因转化率较高的5个基因型为:丰花2号、丰花1号、丰花3号、白沙1016、02P181,丰花2号的基因转化效率最高2.67%,获得的转基因植株经PCR检测呈阳性。

论文目录

摘要

Abstract

1 引言

1.1 花生基因工程研究的意义

1.2 植物启动子研究进展

1.2.1 植物基因启动子核心结构及其功能

1.2.2 植物启动子的类型以及在基因工程中的应用

1.2.3 启动子效率的检测及活性比较

1.2.4 种子特异型启动子在花生分子育种研究上的意义

1.3 农杆菌介导法进行花生基因转化技术体系的研究

1.3.1 农杆菌介导法进行植物基因转化的原理及研究进展

1.3.2 农杆菌介导法基因转化的特点

1.3.3 农杆菌介导法基因转化影响因素的研究

1.3.4 农杆菌介导法基因转化花生的研究历程

1.3.5 农杆菌介导法花生基因转化技术的研究进展

1.4 研究的目的意义及主要内容

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 质粒和菌种

2.1.3 PCR 扩增引物

2.1.4 供试培养基

2.1.5 主要试剂

2.1.6 主要仪器设备

2.2 试验方法

2.2.1 花生叶片总DNA 的提取和纯化

2.2.2 质粒DNA 的少量提取

2.2.3 PCR 扩增体系

2.2.4 PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳观察

2.2.5 目的DNA 片段的克隆和测序

2.2.6 种子特异表达载体的构建

2.2.7 花生胚小叶外植体的制备与基因转化技术的基本流程

2.3 试验设计

2.3.1 种子特异表达载体的构建试验

2.3.2 花生胚小叶再生体系的优化试验

2.3.3 不同基因型花生的基因转化效率比较试验

2.4 计算公式

3 结果与分析

3.1 花生基因组DNA 的提取

3.2 目的片段的PCR 扩增

3.2.1 OLEOSIN 启动子全长及其5’端缺失片段的扩增

3.2.2 ARA H1 启动子全长及其5’端缺失片段的扩增

3.3 目的DNA 片段的克隆

3.3.1 OLEOSIN 启动子的克隆和重组质粒的鉴定

3.3.2 ARA H1 启动子的克隆和重组质粒鉴定

3.3.3 克隆片段的长度对连接效率的影响

3.4 克隆启动子的测序及序列分析

3.4.1 OLEOSIN 启动子的测序及序列分析

3.4.2 ARA H1 启动子的测序及序列分析

3.5 种子特异表达载体的构建

3.5.1 种子特异表达载体PB-OL1584 的构建

3.5.2 种子特异表达载体PB-AH1716 的构建

3.6 花生胚小叶离体再生技术体系的优化

3.6.1 花生胚小叶在五种芽丛诱导培养基上芽丛诱导率的差异分析

3.6.2 芽丛诱导培养基对花生胚小叶植株再生率的影响

3.6.3 在不同芽丛成苗培养基上植株再生率的差异分析

3.7 不同基因型花生的基因转化效率比较

3.7.1 农杆菌侵染后21 个基因型花生愈伤诱导率和芽丛诱导率的差异分析

3.7.2 农杆菌侵染后21 个基因型花生植株再生率的差异分析

3.7.3 21个基因型花生基因转化效率的比较

3.7.4 转Γ-TMT 基因花生植株的PCR 分析

4 讨论

4.1 花生OL1584 及AH1968 启动子的序列分析

4.2 不同长度DNA 片段PCR 扩增方法的优化

4.3 提高目的DNA 克隆和重组子鉴定效率的方法探讨

4.4 双酶切效率影响因素的分析

4.5 激素和基因型对花生胚小叶离体再生效率的影响

4.6 提高花生基因转化效率方法的探讨

4.7 花生组织培养模式的改良及花叶PPT 抗性再生苗的获得

4.8 后续工作

5 结论

5.1 花生种子特异型启动子的克隆及表达载体构建

5.2 花生胚小叶外值体离体再生技术体系的优化

5.3 不同基因型花生的基因转化效率比较

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况

花生种子特异表达载体构建与农杆菌介导基因转化技术体系的优化

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢