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梅山—大白猪肌肉组织差异表达基因的筛选及鉴定

2020-11-28阅读(574)

梅山—大白猪肌肉组织差异表达基因的筛选及鉴定

论文摘要

骨骼肌是动物体内最丰富的组织,约占动物体重的40%,其生长发育相关性状是肉用家畜最重要的性状之一。另一方面,中外猪种在生长速度,肉质等方面存在着较大的差异,大量研究证实这种差异的形成与基因的差异表达有关。为了更好的揭示形成该差异的分子机理,更好的认识骨骼肌的发生发育机理,我们采用抑制消减杂交（SSH）方法构建了梅山—大白猪背最长肌正反向抑制消减杂交文库。并对差异表达基因进行了进一步的筛选和分子生物学特征分析,结果如下:1.用GAPDH和β-actin分别作为检测指标,对梅山猪与大白猪背最长肌正反向消减cDNA文库的消减效率进行检测,消减前后看家基因循环数均相差10个循环以上。说明构建的消减cDNA文库质量较好,可以满足后续工作的需要。2.将所获得的差减cDNA片段连接到pGEM-T克隆载体中,分别得到含有近3000（大白）和2500（梅山）个克隆子的质粒文库。经PCR检测,有效单克隆分别为2739和2109个,阳性率分别为91.3%,84%,其插入cDNA片段大小在0.2-1.2kb之间。3.对消减cDNA文库分别进行斑点杂交验证,阳性率为25%。分别从经斑点杂交筛选过的大白、梅山消减文库中挑选出350个和280个阳性克隆进行测序。测序结果经BLAST软件分析,共代表120个已知基因。其中,以大白为Tester的消减文库中得到的有效序列为313个,合并成101个contigs,代表70个已知基因,5个未知基因和4个全新EST。以梅山为Tester的消减库中得到的有效序列有237个,合并成97个contig,50个已知基因,11个未知基因和5个全新EST。4.经过比较发现,大白消减文库中含糖代谢途径相关的基因较多,而梅山消减文库中线粒体编码的基因较多。5.采用SYBR Green荧光染料法,以HPRT作为内标对其中的部分基因进行了进一步的Real-Time RT-PCR验证。6.对差异表达基因丙酮酸脱氢酶激酶4（Pyruvate dehydrogenase kinase 4,PDK4）进行进一步的分析。经斑点杂交和半定量RT-PCR验证,发现该基因在四月龄梅山猪中较高水平表达。（1）对PDK4检测其在大白,梅山中不同发育阶段（胚胎65天,出生后3天,5周龄,2月龄,4月龄,6月龄）的表达量,发现其具有相似的表达趋势,其中,在初生（3天）时的表达量最高,之后逐渐降低,到3周龄时表达明显下降,至5周龄达到最低,之后在梅山中又有所上升,但在梅山4月龄和6月龄表达量都较低。（2）比较各阶段大白,梅山之间的表达发现,梅山在胚胎期,出生后3天,5周龄,2月龄,4月龄都显著高于大白,在6月龄时大白猪中的表达量略高于梅山。（3）对其进行了组织表达潜分析,结果显示,其在骨骼肌中的表达量较高,在脂肪中的表达量较低。（4）结合电脑克隆和RACE技术,成功克隆得到其全长共3589bp和第四（162bp）,九（299bp）,十（1696bp）内含子序列。并对其进行了序列分析和进化树分析。发现该基因与牛亲缘关系较近,与鸡,爪蟾亲缘关系较远。（5）多态性分析:对第九内含子中的一个G/A突变位点用PCR-SSCP的方法在实验室2003,2004年建立的大梅F2代资源家系311个个体中分析并与其相应生产性状进行关联,结果显示,该位点与至第一肋胸、瘦肥肉比例、失水率、系水力、LD肌肉色值、脂肪含量、水分含量等性状有显著（p＜0.05）或极显著（p＜0.01）相关。（6）克隆得到长约2.3kb长的启动子序列,通过序列分析,发现上面有很多跟肌肉发育相关的转录因子结合位点。通过与人比对发现,其中的一段与人的相似性高达70%,为相对保守序列,推测该段序列在该基因的表达中起着重要的作用。7.对前期实验室筛选的一个亲代大白和子代长大猪肌肉组织差异表达EST基础上克隆了基因ERBB2转换子1（TRANSDUCER OF ERBB2,1,TOB1）,并对其进行了进一步的分析。（1）结合电脑克隆和RACE技术,以大白背最长肌SMART cDNA为模板,克隆得到其mRNA全长共2263bp。其中CDS 1044bp,编码347aa。对其3’UTR区分析发现,该基因的3’UTR区域存在多个AU序列（ATTTA）,该序列与基因的快速降解（稳定性）有关,表明该基因是属于早期应答基因,在体内起调控作用。（2）对其进行了进化树分析,发现该基因与灵长类亲缘关系较近。（3）通过四品种TOB1基因对应蛋白序列比对,发现了六处氨基酸的改变。（4）对该基因在四月龄大白,梅山中的RNA表达水平进行分析比较,发现该基因在四月龄梅山猪中的RNA表达量高于大白猪。（5）比较TOB1基因在大白,梅山各发育阶段的RNA表达水平,发现其在梅山各阶段的表达量都明显高于大白。且变化趋势相似。即从胚胎65d到6月龄表达量逐渐升高,但在两月龄中表达量较低。（6）对其进行了组织表达谱分析,结果显示,其在骨骼肌中的表达量较高,在脂肪中的表达量较低。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略词表
  • 1 前言
  • 1.1 研究问题的由来
  • 1.2 骨骼肌细胞的发生发育过程
  • 1.3 肌纤维分类及特征
  • 1.4 肌纤维组成与肌肉品质
  • 1.5 影响肌纤维分布的因素
  • 1.5.1 品种
  • 1.5.2 肌肉类型
  • 1.5.3 性别和年龄
  • 1.5.4 激素
  • 1.5.5 其他
  • 1.6 骨骼肌细胞发生发育中的分子调控
  • 1.6.1 MRFs转录因子家族
  • 1.6.2 MEF2转录因子家族
  • 1.6.3 Pax3和Pax7基因
  • 1.6.4 HATs和HDACs基因
  • 1.6.5 N-cadherin和β-Catenin
  • 1.6.6 Wnt信号途径
  • 1.7 猪骨骼肌差异表达基因研究进展
  • 1.7.1 基因差异表达研究方法
  • 1.7.1.1 RNA差异显示技术
  • 1.7.1.2 抑制消减杂交技术
  • 1.7.1.3 cDNA微阵列和基因芯片
  • 1.7.1.4 基因表达连续分析
  • 1.7.2 猪骨骼肌基因差异表达研究现状
  • 1.8 研究目的和意义
  • 2 材料与方法
  • 2.1 主要仪器与设备
  • 2.2 试剂盒、试剂、载体及菌株
  • 2.2.1 试剂盒
  • 2.2.2 试剂
  • 2.2.3 主要溶液的配制
  • 2.2.4 载体、菌株及其它
  • 2.3 材料来源与样品制备
  • 2.3.1 总RNA分离
  • 2.3.1.1 建库用总RNA分离
  • 2.3.1.2 TRlpure试剂法分离总RNA
  • 2.3.2 猪基因组DNA的提取
  • 2.3.3 质量检测
  • 2.3.3.1 RNA浓度和纯度检测
  • 2.3.3.2 基因组DNA浓度和纯度检测
  • 2.4 SMART cDNA合成
  • 2.4.1 样品
  • 2.4.2 合成SMART dscDNA
  • 2.5 抑制消减杂交
  • 2.5.1 Driver cDNA和Tester cDNA的制备
  • 2.5.1.1 双链cDNA纯化
  • 2.5.1.2 Rsa Ⅰ内切酶消化
  • 2.5.1.3 Driver cDNA的制备
  • 2.5.1.4 Tester cDNA的制备
  • 2.5.2 接头连接效率的检测
  • 2.5.2.1 检测连接效率的引物组合
  • 2.5.2.2 效率检测
  • 2.5.3 消减杂交
  • 2.5.4 PCR扩增富集
  • 2.5.5 消减效率的检测
  • 2.6 消减cDNA文库的构建及鉴定
  • 2.6.1 消减文库的构建
  • 2.6.1.1 载体连接
  • 2.6.1.2 感受态细胞的制备
  • 2.6.1.3 转化
  • 2.6.1.4 挑取阳性克隆
  • 2.6.2 消减cDNA文库的PCR筛选
  • 2.6.3 斑点杂交筛选阳性克降
  • 2.6.3.1 探针的制备
  • 2.6.3.2 斑点杂交
  • 2.7 阳性克隆cDNA片段测序及序列分析
  • 2.7.1 阳性克隆测序
  • 2.7.2 EST序列分析
  • 2.7.3 EST对应的基因功能分类
  • 2.8 差异表达基因的RT-PCR验证
  • 2.8.1 定量PCR引物设计
  • 2.8.2 cDNA的合成
  • 2.8.3 半定量RT-PCR反应
  • 2.8.4 定量RT-PCR反应
  • 2.9 差异表达基因的分析
  • 2.9.1 差异基因组织表达分析
  • 2.9.1.1 RNA的制备
  • 2.9.1.2 RT-PCR反应
  • 2.9.2 基因全长cDNA克隆
  • 2.9.2.1 电子延伸
  • 2.9.2.2 RACE-PCR
  • 2.9.3 序列分析
  • 2.9.4 基因组片段的扩增
  • 2.9.5 SNP的寻找及突变位点分析
  • 2.9.5.1 计算机软件进行突变位点的找寻及验证
  • 2.9.5.2 突变位点的PCR-SSCP分析
  • 2.9.5.3 数据统计分析
  • 2.9.6 启动子序列获得与预测
  • 3 结果与分析
  • 3.1 总RNA的提取
  • 3.2 SMART dscDNA合成
  • 3.3 抑制消减杂交
  • 3.3.1 Driver cDNA和Tester cDNA的制备
  • 3.3.2 消减效率的检测
  • 3.4 消减cDNA文库的构建和筛选
  • 3.4.1 PCR鉴定
  • 3.4.2 斑点杂交验证
  • 3.5 阳性克隆测序及序列分析
  • 3.5.1 克隆测序
  • 3.5.2 EST聚类分析
  • 3.5.3 基因功能注释
  • 3.5.4 基因功能归类
  • 3.6 部分基因的实时定量PCR检测
  • 3.6.1 标准曲线
  • 3.6.2 熔解曲线
  • 3.6.3 差异表达基因的实时定量RT-PCR验证
  • 3.7 差异表达基因PDK4分子生物学特征分析
  • 3.7.1 PDK4基因的斑点杂交验证和半定量验证
  • 3.7.2 PDK4基因的时空表达分析
  • 3.7.3 全长cDNA克隆及序列分析
  • 3.7.4 突变位点的寻找及性状关联分析
  • 3.7.5 启动子序列扩增及分析
  • 3.8 差异表达基因TOB1的分子生物学特征分析
  • 3.8.1 TOB1在大白、梅山中的差异表达分析
  • 3.8.2 猪TOB1基因全长的获得及序列分析
  • 3.8.3 不同品种猪TOB1蛋白的序列突变分析
  • 3.8.4 TOB1基因的时空表达分析
  • 4 讨论
  • 4.1 抑制消减杂交技术
  • 4.2 荧光定量PCR
  • 4.3 内参的选择
  • 4.4 差异表达文库分析
  • 4.5 差异表达基因PDK4
  • 4.6 差异表达基因TOB1
  • 小结
  • 主要研究结果
  • 主要创新点
  • 本研究的不足之处
  • 下一步工作计划
  • 参考文献
  • 附录一 用于表达分析的引物
  • 附录二 用于基因克隆的引物
  • 论文发表情况
  • 致谢

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