论文摘要
生物大分子所构筑的细胞表面(细胞壁、细胞膜)是细胞与外界环境间进行物质和能量交换的屏障,也是一些物理、化学因素作用于细胞的靶点之所在。在纳米水平上研究细胞表面的基本结构及其受外界环境作用前后的变化,对于认识细胞表面结构与功能之间的关系,全面评价药效并对药物合成路线提供参考都具有重要意义。另一方面,单碱基错配的检测对于从分子水平上阐明多种疾病形成的原因,实现基因水平的治疗都是至关重要的前提条件。发展具有高灵敏度、高选择性的单碱基错配检测方法势在必行。上述两个研究领域都已经成为生物分析化学研究的前沿和热点。本论文以上述科学问题为研究目标,充分利用原子力显微镜(AFM)能够在大气及液下高分辨成像和对微弱相互作用力敏感的优势,表征了不同药物以及脉冲电场(PEF)对细菌细胞壁表面形态和构成的影响,考察了细胞在大气氛和液下成像的条件,发展了基于力测定并结合发夹型探针的高灵敏、高选择性的单碱基错配检测方法。主要内容归纳如下:1、基于AFM大气氛中成像,研究天然与半合成内酰胺类抗生素对大肠杆菌形态的影响。选择具有微小分子结构差别的天然(青霉素)和半合成(阿莫西林)抗生素,分别对大肠杆菌进行作用。利用AFM大气氛中制样简便、轻敲模式成像分辨率高、样品损伤性小的优势,对药物的作用效果进行了表征。观察到这两种药物在细菌表面造成的纳米水平上小孔状损伤的密度和发生位点均存在区别,从形态学角度解释了阿莫西林比青霉素药效强的原因。作为对照的氧氟沙星未使细菌表面出现显著的损伤。该结果在纳米水平上证明了不同抗生素的药效,同时也表明AFM能够为研究药物分子结构与作用效果的关系提供新的表征手段。2、结合AFM液下成像和力测定两种技术,研究了PEF对细菌表面结构与构成的影响。对通过静电吸附固定于基底上的细菌样品,原位施加不同剂量的PEF,表征了菌体形态及其与AFM探针的相互作用力的变化。结果表明随着PEF剂量的增加,细菌表面损伤的程度逐渐增大,具体表现为细菌数目的减少、相互作用力的增大以及力曲线上出现多粘附相互作用特征区。对照实验表明相互作用力的变化是由于细胞壁外层的肽聚糖分子网络状结构被破坏,从而使内膜中的蛋白组分暴露所致。该结果在分子水平上证明了PEF对细菌表面的影响,同时也表明AFM是研究细胞表面组分变化与外界物化刺激之间相互关系的强有力的工具。3、气氛中及生理环境下AFM细胞成像的实现及条件优化。首先,比较了三种常用的固定剂对三种细胞在大气氛中成像效果的影响。其中,0.5%的戊二醛具有对细胞细微结构的最佳保留能力。在此基础上,进一步考察了扫描速度和不同培养基环境对细胞液下成像的影响并进行了条件优化。贴壁生长的肾系膜细胞和肾小管上皮细胞均可在培养基中直接进行成像,细胞骨架清晰。该结果为将AFM成像和力测定及其联用技术应用到细胞水平搭建了一座桥梁。4、AFM力谱分析用于增强发夹型探针的单碱基错配检测能力。我们将探针与完全互补和一系列含有不同类型单碱基错配的互补序列分别修饰到针尖与基底上,通过测量探针与完全互补以及错配序列之间的相互作用力,对单碱基错配进行检测。不同于荧光检测时灵敏度受到碱基错配位置和序列中GC含量的显著影响,这种分子水平的相互作用在检测时不受错配碱基类型和位置的影响,均可实现高灵敏度检测。该方法解决了在利用荧光方法检测单碱基错配时,发夹型探针存在的序列依赖性问题,大大增强了发夹型探针的错配检测能力。