论文题目: 中国H9N2亚型禽流感病毒进化分析与H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 预防兽医学
作者: 李呈军
导师: 于康震
关键词: 禽流感病毒,进化分析,标记疫苗
文献来源: 中国农业科学院
发表年度: 2005
论文摘要: 我国在1994年从广东省分离到第一株H9N2亚型禽流感病毒（AIV）,此后,该亚型病毒在全国范围内广泛流行。本研究对1996-2002年中国大陆分离到的27株H9N2亚型AIV进行了系统的进化分析,其目的是为如下问题提供答案:1)中国大陆H9N2亚型AIV的遗传演化关系如何? 2)是否具备感染哺乳动物的能力? 3)它们的抗原性关系如何,是否出现了抗原变异株? 27株病毒以106EID50的剂量鼻腔感染SPF鸡,表明所有病毒均为低致病性毒株。抗原性分析表明,这些病毒的抗原性比较复杂,出现了多株抗原变异株。CK/GX/10/99,CK/HLJ/35/00和CK/SH/10/01三株病毒的灭活疫苗免疫保护实验结果表明,只有CK/SH/10/01疫苗可以对同源病毒攻击产生完全的免疫保护,而且灭活疫苗对异源的CK/SH/10/01和CK/GX/10/99病毒的交叉免疫保护效果很差,攻毒后有多只鸡排毒。 进一步利用BALB/c小鼠模型评价H9N2亚型AIV对哺乳动物的感染能力,根据感染后小鼠的体重变化和病毒在小鼠肺脏中的生长滴度,将27株病毒分为3组。第一组5株病毒感染小鼠后在肺脏中未分离到病毒,小鼠不致病,体重不下降。第二组包括14株病毒,其中11株病毒感染后3天肺脏病毒滴度在2.8-5.8log10EID50/ml之间,另外3株病毒感染后3天未从小鼠肺脏中分离到,感染后5天则可以检测到较低水平的病毒复制,该组病毒感染后小鼠体重持续增长或仅引起低于5%的体重下降。第三组8株病毒感染小鼠后3天肺脏病毒滴度在6.0-7.3log10EID50/ml之间,其中7株病毒可导致小鼠出现明显的发病症状,体重下降10-20%。 遗传演化分析表明,所有病毒都是起源于CK/BJ/1/94-like病毒,并且在进化过程中发生了复杂的基因重组,由QA/HK/G1/97,TY/WI/66,CK/HK/G9/97或CK/SH/F/98病毒获得了某些基因片段,形成了9个不同的基因型。发现3株病毒的M2蛋白的31位由S突变为N,经过试验证实这些病毒获得了对金刚烷胺的抗药性。 本研究系统的阐明了我国H9N2亚型AIV的生物学及遗传多样性。这些病毒对家禽呈低致病性,这就使得其更易于传播扩散;多数病毒获得了感染哺乳动物并在其体内有效复制的能力,因此有可能演变成引起人类流感流行的病毒;这些病毒之间存在显著的抗原性差异,而且出现了抗药性毒株,这就为有效防制带来了极大的困难。因此,必须对H9N2亚型禽流感的防制给予足够的重视。 H5N1亚型禽流感的暴发给世界养禽业造成毁灭性打击。疫苗免疫是防制高致病性H5N1亚型禽流感的重要手段,能与自然感染相区别的免疫措施对禽流感的控制和根除非常重要。本研究利用反向遗传操作技术人工救获了H5N1亚型重组流感病毒疫苗株H5N1/PR8-5819,其6个内部基因来源于高滴度鸡胚适应株PR8,HA和NA基因来源于我国分离的第一株H5N1亚型禽流感病毒GS/GD/1/96。通过分子修饰去除了HA基因裂解位点的多个连续碱性氨基酸,使其具备了低致病
论文目录:
第一章 引言
1 流感病毒致病力、宿主范围和种间传播的决定因素
1.1 流感病毒的复制
1.2 流感病毒表面蛋白HA和NA对致病力的影响
1.3 流感病毒在宿主细胞内的复制能力
1.4 流感病毒与细胞凋亡
1.5 流感病毒与宿主的免疫反应
1.6 流感病毒在宿主体内的适应，进化，持续感染和种间传播
2 禽流感流行现状
2.1 H5和H7亚型禽流感
2.2 H9N2亚型禽流感
3 禽流感疫苗
3.1 灭活全病毒疫苗
3.2 亚单位疫苗
3.3 重组活载体疫苗
3.4 DNA疫苗
3.5 标记疫苗
4 A型流感病毒的反向遗传技术
4.1 流感病毒反向遗传技术的发展过程
4.2 流感病毒反向遗传技术的应用
5 本研究的目的和意义
第二章 H9N2亚型禽流感病毒的抗原性分析及部分毒株的免疫原性分析
1 材料与方法
1.1 病毒分离株
1.2 SPF鸡和SPF鸡胚
1.3 分型、鉴定用血清
1.4 病毒分离及有限稀释克隆纯化
1.5 鸡胚半数感染量(EID_(50))测定
1.6 病毒的抗原性分析
1.7 三株H9N2亚型禽流感病毒的鼻腔感染试验和灭活疫苗免疫原性分析
2 结果
2.1 鸡胚半数感染量(EID_(50))测定结果
2.2 抗原性分析
2.3 三株H9N2亚型病毒的感染试验和交叉免疫分析
3 讨论
第三章 H9N2亚型禽流感病毒对小鼠的致病性研究
1 材料与方法
1.1 实验用毒株
1.2 实验动物
1.3 27株病毒对小鼠的致病性试验
1.4 小鼠脏器的病毒滴定
1.5 8株首次感染试验对小鼠无感染性病毒验证试验
2 结果
2.1 小鼠体重变化结果
2.2 27株H9N2禽流感病毒鼻腔感染BALB／c小鼠脏器病毒分离结果
2.3 8株病毒对小鼠感染性验证试验
2.4 27株病毒对小鼠感染性划分
3 讨论
第四章 H9N2亚型禽流感病毒进化分析
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 遗化演化分析
2 结果
2.1 序列测定结果
2.2 HA基因
2.3 NA基因
2.4 PB2基因
2.5 PB1基因
2.6 PA基因
2.7 NP基因
2.8 M基因
2.9 NS基因
2.10 27株H9N2亚型禽流感病毒基因型划分结果
3 讨论
3.1 关于遗传演化分析
3.2 关于HA基因氨基酸序列分析
3.3 关于NA基因的氨基酸序列
第五章 部分H9N2亚型禽流感病毒对金刚烷胺抗药性研究
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 七株H9N2亚型禽流感病毒细胞半数感染量(TCID_(50))的测定
1.3 七株H9N2亚型禽流感病毒对金刚烷胺类药物1-adamantylamine的敏感性试验
2 结果
2.1 组织半数感染量(TCID_(50))测定结果
2.2 对1-adamantylamine抗药性分析结果
3 讨论
第六章 H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗的初步研究
1 材料与方法
1.1 病毒株
1.2 SPF鸡和SPF鸡胚
1.3 质粒载体及转染质粒
1.4 主要试剂和仪器
1.5 病毒RNA提取、反转录和PCR
1.6 序列测定
1.7 引物
1.8 HA和NA转染质粒pBD-MutHA和pBD-NA-5B19的构建
1.9 分子致弱的H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗株H5N1／PR8-5B19的救获
1.10 H5N1／PR8-5B19疫苗株的生物学特性
1.11 一种能够区分H5N1／PR8-5B19标记疫苗免疫血清和非标记疫苗免疫血清或自然感染鸡血清的ELISA检测方法的初步建立
1.12 H5N1／PR8-5B19疫苗免疫试验
2 结果
2.1 pBD-MutHA质粒构建
2.2 pBD-NA-5B19质粒构建
2.3 H5N1／PR8-5B19的救获和病毒鉴定
2.4 H5N1／PR8-5B19疫苗株的生物学特性
2.5 多肽ELISA方法的初步建立
2.6 标记疫苗免疫后HI抗体和5B19表位ELISA抗体的检测
2.7 标记疫苗免疫保护试验
3 讨论
结论
参考文献
附录
附录1 27株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列
附录2 H5N1／PR8-5B19病毒分子修饰的HA和NA基因
致谢
简历
发布时间: 2005-09-05
参考文献
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