肝细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞治疗心肌病心力衰竭的实验研究

论文摘要

第一部分携带肝细胞生长因子的腺病毒在骨髓间充质干细胞细胞的表达目的:将带有人肝细胞生长因子（hHGF）和绿色荧光蛋白（GFP）基因的腺病毒载体,感染大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,观察其感染率及hHGF的表达。方法:将构建好的携带hHGF基因的腺病毒载体（Ad-hHGF ）和携带GFP基因的腺病毒载体（Ad-GFP）进行体外扩增、病毒滴度测定,提取新鲜骨髓,体外分离、培养并鉴定MSCs。将带有hHGF和GFP基因的腺病毒载体,感染第3-4代MSCs,通过流式细胞仪观察感染率及通过酶联免疫吸附试验（ELISA ）检测hHGF在MSCs中的表达。结果:病毒扩增后噬斑试验测定Ad-GFP的病毒滴度为7.8 x1010pfu/ml ,Ad-hHGF的病毒滴度为1.3 x1010 pfu/ml。Ad-GFP感染MSCs,感染率随MOI的增加而增加,当感染复数（MOI）值为100时,感染率达到99.3%。ELISA检测结果显示,Ad-hHGF感染MSCs第8天,hHGF表达含量达到峰值（22ng/ml）,16天时,仍可检测到hHGF。结论:①MSC是一种理想的基因载体细胞,可用于HGF的基因治疗。②感染Ad-hHGF的MSC, HGF有短期（2周左右）和高效表达。第二部分Ad-hHGF-rMSCs静脉移植对大鼠心肌病心力衰竭功能及机理的研究目的:Ad-hHGF感染MSCs后,经尾静脉注入心肌病心力衰竭大鼠体内,观察其在心肌内存活情况及各组大鼠心功能、血生化等指标的变化,并探讨引起变化的机制。方法:通过腹腔注射阿霉素制作SD大鼠心肌病心力衰竭模型,随机分为模型组、MSCs组、MSCs-hHGF组和正常对照组,MSCs-hHGF组经尾静脉注射Ad-hHGF感染的MSC 3x106/100ul,MSCs组注射MSCs 3x106/100ul,模型组和正常对照组注射磷酸盐缓冲液（PBS）各100ul,各组大鼠分别于移植后不同时间收集血浆检测hHGF蛋白,移植后4周,应用生理信号系统检测心功能,并收集各组大鼠血浆检测心钠肽（ANP）、肿瘤坏死因子-a（TNF-a）、内皮素（ET）、肌钙蛋白T（TnT）,白介素-6（IL-6）等内分泌指标。HE染色及电镜观察各组大鼠心肌组织病理改变情况,天狼星红染色观察胶原增生,同时在荧光显微镜下观察移植细胞的分布情况,免疫组化技术检测VIII因子和转化生长因子β1（TGF-β1）的表达。结果:MSCs-hHGF组大鼠血浆中可以检测到hHGF蛋白的表达,第9天含量最高,4周后仍可检测到,而其他组并没有检测到。与模型照相比,MSCs组和MSCs-hHGF组大鼠心功能明显改善,差异有统计学意义（p<0.01）,而两移植组间亦有统计学意义（p<0.05）,MSCs-hHGF组优于MSCs组。移植后4周,MSC-HGF组和MSC组血浆中TNF-a的放射性计数（cpm）值较模型组增高（p <0.05）,ET、ANP明显增高（p <0.01）cTnT明显降低（p <0.01）,三组之间,IL-6无统计学意义。与MSC组相比较, MSC-HGF组血浆ANP、ET的CPM明显增高（p <0.01） cTnT明显降低（p <0.01）,IL-6和TNF-a两组之间没有显著差别。大鼠组织学观察,与模型组相比,两移植组心肌组织结构恢复较好。两移植组在荧光激发下均可见4,6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）标记的阳性细胞聚集在病变心肌并存活,其中MSCs-hHGF组中可见更多存活的DAPI标记的细胞。与对照组相比较,两移植组中VIII表达明显增多,和转化生长因子β1的表达显著降低,（p<0.01）,而两移植组间亦有统计学意义（p<0.05）结论: Ad-hHGF感染的MSC经尾静脉移植后在宿主心肌内能够存活。rMSCs与hHGF可协同作用促进心肌病心力衰竭大鼠心功能的恢复,其机制可能为心肌细胞形成,血浆hHGF的表达,血管生成和胶原减少有关等。

论文目录

• 英文缩略词
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 携带肝细胞生长因子的腺病毒在 骨髓间充质干细胞的表达
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 第二部分 Ad-hHGF-rMSCs 静脉移植对大鼠心肌病 心力衰竭功能及机理的研究
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 综述 基因联合骨髓间充质干细胞移植治疗心力衰竭
• 参考文献