论文摘要
奎尼酸是一种具有极高价值的精细化工产品和医药中间体，在医药工业、食品工业、化工等行业均有较大的用途。本研究是将代谢工程技术应用于产奎尼酸基因工程菌的构建。根据代谢工程原理系统分析了细胞代谢网络，并利用DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及其遗传修饰，进而完成细胞特性改造。目的是在大肠杆菌中构建奎尼酸生物合成途径，将碳代谢流最大程度的引向奎尼酸生成的方向。利用大肠杆菌莽草酸途径合成新的代谢物奎尼酸，需要提高上游几种代谢中间产物PEP、E4P、DAHP、DHQ的含量，与之对应的编码其合成酶的几种基因分别是ppsA、tktA、aroG、aroB。另外须在宿主细胞引入编码与奎尼酸合成有关的异源酶基因扩展代谢途径，然后串联表达酶基因，同时适量增加不同种属的多个关键酶的有效含量，改善限速反应。利用同源重组进行基因整合和基因破坏，改造染色体结构定向改变微生物代谢途径。本文主要从以下几个方面对奎尼酸基因工程菌进行了改造：1．编码奎尼酸脱氢酶的qutB基因是来自于构巢曲霉。在现有的基础上构建了一系列包含qutB基因的表达重组质粒。SD序列与起始密码子不同距离的pBVqutB1，pBVqutB2；具有qutB双拷贝三基因串联的pBVqutBqutBaroG；具有ppsA、tktA、qutB三基因串联的pBVPTB，以及新构建的单基因重组质粒pETqutB，pBVtacqutB，pTrcqutB。并对含有qutB基因的一系列重组质粒在大肠杆菌中进行了表达与否的验证。结果显示pTrcqutB，pBVtacqutB没有特异的蛋白表达带，说明pTrc99a和pBVtac载体不适合用于qutB基因的表达。pETqutB经过IPTG诱导后有特异的蛋白表达，并且在2—5小时内随着时间的延长而增加，但是时间更长（7h）则因为蛋白降解而出现表达蛋白减少的迹象。pBVqutB1和pBVqutB2同本实验室保存的pBVqutB没有出现明显的蛋白表达量上的差异，这说明利用pBV220表达载体表达qutB基因，起始密码子与SD序列之间距离的远近并不是影响其表达量的关键。含有两个qutB基因和一个aroG基因的多基因串连质粒pBVqutBqutBaroG，经过热诱导，也出现了非常明显的表达条带。2．对含有qutB基因在大肠杆菌中可以表达几种重组质粒进行酶活测定，与含有pBVqutB的对照菌相比，含有pBVqutB1，pBVqutB2的菌株的奎尼酸脱氢酶的酶活没有明显变化，三基因串联的pBVqutBqutBaroG甚至出现了酶活降低的现象。3．成功地从粗糙脉孢菌的基因组中克隆了奎尼酸脱氢酶的基因qa-3，并与几种表达载体连接得到了pBVqa3、pETqa3、pBVtacqa3、pTrcqa3，但是这些质粒重组子在大肠杆菌中均没有观察到该基因的特异表达条带。4．结合qa-3基因的密码子的特点和计算机模拟的mRNA二级结构，对qa-3基因的密码子和mRNA二级结构进行改造，优化该基因的密码子结构，降低形成mRNA二级结构的自由能，得到新的基因qa3RGm。构建的pBVqa3RGm重组质粒在大肠杆菌中成功的表达了奎尼酸脱氢酶，酶活也比对照明显提高。同时还构建了ppsA、tktA、qa3RGm三基因串联的重组质粒pBVPTA。5．成功的构建了pUC-DK、pUC-DAK、pUC-DBK并制备了线性化片段DK、DAK、DBK，为基因敲除和基因替换做好了准备。利用Red重组系统成功的地进行了基因敲除和基因替换，并稳定了敲除和替换菌株的基因型，把这株菌株定名为大肠杆菌31K。6．成功的构建奎尼酸发酵的工程菌5、AP、B、A、BP、5K、APK、BK、AK、BPK、220K。通过实验室摇瓶初步发酵，在硅胶板上可以初步确定，菌株AP（31BK/pBVPTA）产生的奎尼酸量最大，也最稳定。7．将菌株AP扩大摇瓶发酵的规模，然后经过树脂富集，HPLC制备，得到了微量的奎尼酸样品。经过红外光谱、核磁共振、电子喷雾质谱以及紫外、液质联用等的鉴定可以确定与奎尼酸标准品无差异，由此可以确定我们利用生物合成并且分离鉴定了奎尼酸。总之，为了合成奎尼酸并提高其产量，本研究从分子进化、基因重组、网络构建等不同的方面对奎尼酸生物合成进行了许多有益尝试，既为研究奎尼酸的生物合成奠定了基础，也为基因工程应用于代谢工程提供一定的借鉴意义。
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