论文题目: 嗜碱芽孢杆菌N16-5碱性甘露聚糖酶的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 发酵工程
作者: 马延和
导师: 陶文沂
关键词: 嗜碱微生物,碱性,甘露聚糖酶,纯化表征,基因克隆,发酵条件,应用
文献来源: 江南大学
发表年度: 2005
论文摘要: β-甘露聚糖酶是第二大半纤维素酶类,在食品、医药、纺织、洗涤剂、造纸、饲料、石油开采等方面具有广泛的应用前景,碱性β-甘露聚糖酶具有特殊的应用优势,从碱湖嗜碱微生物资源中发掘新的碱性β-甘露聚糖酶具有很大的发展潜力。本文从分析我国碱湖微生物资源入手,进行了新型的碱性甘露聚糖酶产生菌的筛选、发酵条件优化、酶学表征、基因克隆、嗜碱机制以及工业应用评价等方面的研究,为我国工业用酶的开发提供新的思路与途径。论文取得的主要结果如下:(1)应用分子生态学的方法评估了我国碱湖中细菌的多样性,发现了碱湖环境中存在革兰氏阴性菌中变形菌纲α和β两个亚群及革兰氏阳性菌4个新的分类单位。在此基础上对来自我国内蒙、西藏等碱湖样品进行了嗜碱菌的分离培养与系统发育学分析,获得了嗜碱细菌106株,其最适生长pH范围集中在9-10之间,完成了其中32株嗜碱菌的系统发育学分析,有21株菌的16S rDNA序列同源性低于97%,可能是新的分类单位。分离获得的菌株N10是变形菌纲γ-3亚群中的成员,做为一个新属的模式菌,定名为淀粉水解嗜碱单胞菌(Alkalimonas amylolytica)。首次证明了Halomonas和BacillusrRNA第7类群是碱湖中主要的多糖水解酶产生者。从上述嗜碱菌中筛选获得了22株β-甘露聚糖酶产生菌,其中嗜碱菌N16-5能够高水平产生碱性甘露聚糖酶,经鉴定表明该菌属于Bacillus属的一新种,定名为解甘露聚糖芽孢杆菌Bacillus mannanolyticus sp.nov.。(2)研究了嗜碱菌N16-5产碱性甘露聚糖酶的营养及环境条件的优化及放大工艺,在优化条件下该菌株在250L和1000L罐中产酶水平可达470U/mL;该菌株发酵液粗酶的最适反应pH为9.5-10.0,最适反应温度为70℃,水解魔芋粉和槐豆胶的产物以寡糖为主。(3)对菌株Nl6-5的β-甘露聚糖酶进行了分离纯化与表征,获得了三种不同分子量的β-甘露聚糖酶M1、M2和M3,其分子量分别为51kD、38kD和34.7kD,最适作用pH分别为9.0、10.0和10.0。其中,M1和M3在pH10.0条件下最为稳定,而M2在pH8.0-10.0范围内稳定。上述三种酶的最适作用温度皆为70℃,对大部分金属离子不敏感,对魔芋葡萄甘露聚糖底物的Km值分别为2.9、1.7和12.5mg/mL。。(4)克隆了菌株N16-5的碱性甘露聚糖酶A(M1)基因,基因片段全长为1479 bp,编码493个氨基酸残基,推断分子量为54215 Da,属于糖苷水解酶家族5的A8亚族,
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英文摘要
第一章 绪论
1.1 甘露聚糖与甘露聚糖酶
1.1.1 甘露聚糖
1.1.2 甘露聚糖酶系的组成及作用特点
1.2 β-甘露聚糖酶的来源
1.2.1 高等植物甘露聚糖酶
1.2.2 动物来源的甘露聚糖酶
1.2.3 微生物来源的甘露聚糖酶
1.3 甘露聚糖酶的分离纯化与表征
1.3.1 甘露聚糖酶的纯化
1.3.2 β-甘露聚糖酶的晶状结构
1.3.3 催化中心的氨基酸残基
1.4 β-甘露聚糖酶基因克隆
1.4.1 一级序列特征
1.4.2 催化域和结合域
1.5 β-甘露聚糖酶的生产
1.6 甘露聚糖酶的应用
1.6.1 饲料添加剂
1.6.2 在食品加工中应用
1.6.3 在甘露寡糖生产中的应用
1.6.4 造纸洗涤等行业中的应用
1.7 本论文的研究目的及意义
第二章 碱湖嗜碱菌多样性分析及碱性甘露聚糖酶产生菌嗜碱芽孢杆菌N16-5 的筛选、鉴定
2.1 材料与方法
2.1.1 样品来源
2.1.2 培养基
2.1.3 菌株的分离纯化和保存
2.1.4 菌株的分类特征
2.1.5 碱湖沉积物中的165 rDNA 文库构建
2.2 结果与讨论
2.2.1 碱湖中细菌多样性的分子生态学研究
2.2.2 碱湖中微生物菌株的分离和分子发育系统分析
2.2.3 产水解酶的嗜碱菌多样性研究
2.2.4 碱性甘露聚糖酶产生菌――嗜碱菌N16-5 的特征
2.3 本章主要结论
第三章 嗜碱芽孢杆菌N16-5 碱性甘露聚糖酶的发酵条件与粗酶性质
3.1 材料与方法
3.1.1 菌种
3.1.2 培养基及培养条件
3.1.3 粗酶的制备
3.1.4 粗酶性质的研究
3.1.5 N16-5 粗甘露聚糖酶对木聚糖的降解及产物分析
3.1.6 菌体生长测定
3.1.7 总糖的测定
3.1.8 还原糖的测定
3.1.9 谷氨酸钠的测定
3.1.10 甘露聚糖酶的活性测定
3.2 结果与讨论
3.2.1 菌株N16-5 产β-甘露聚糖酶的条件
3.2.2 16L 自控罐试验中菌株N16-5 甘露聚糖酶的发酵工艺研究
3.2.3 N16-5 碱性甘露聚糖酶的250L 及1000L 罐发酵试验
3.2.4 菌株N16-5 产甘露聚糖酶的性质
3.2.5 讨论
3.3 本章主要结论
第四章 嗜碱芽孢杆菌N16-5 碱性甘露聚糖酶的纯化及酶学性质
4.1 材料与方法
4.1.1 菌种与粗酶的制备
4.1.2 主要仪器与试剂
4.1.3 蛋白质测定
4.1.4 电泳分析
4.1.5 N16-5 甘露聚糖酶对甘露聚糖降解产物的分析
4.1.6 甘露聚糖酶的活性测定
4.2 结果与讨论
4.2.1 碱性β-甘露聚糖酶的纯化
4.2.2 酶的基本性质
4.3 本章的主要结论
第五章 嗜碱芽孢杆菌N16-5 碱性甘露聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达
5.1 材料与方法
5.1.1 菌株、质粒和培养方法
5.1.2 非变性胶活性电泳及N-末端氨基酸测序
5.1.3 基因克隆操作步骤
5.1.4 ManA 基因在毕赤酵母中的表达
5.1.5 甘露聚糖酶测定
5.2 结果与讨论
5.2.1 菌株N16-5 的β-甘露聚糖酶M1 的基本特性
5.2.2 甘露聚糖酶ManA(M1)基因的克隆及序列分析
5.2.3 ManA(M1)蛋白的一级结构分析
5.2.4 甘露聚糖酶ManA(M1)基因在毕氏酵母中的表达
5.3 本章的主要结论
第六章 嗜碱芽孢杆菌N16-5 碱性甘露聚糖酶嗜碱性分子机制的初步研究
6.1 材料与方法
6.1.1 菌株、质粒和培养方法
6.1.2 碱性甘露聚糖酶基因的突变
6.1.3 碱性甘露聚糖酶活性的测定
6.2 结果与讨论
6.2.1 β-甘露聚糖酶氨基酸组成特征
6.2.2 酶基因C 末端酶切与活性分析
6.2.3 携带有最适pH 变化的突变型酶基因重组子的筛选结果
6.2.4 突变型酶蛋白质(ManAM)序列和与野生型酶(ManA)蛋白质序列比较结果
6.2.5 野生型甘露聚糖酶及其几种突变型甘露聚糖酶的特性比较
6.2.6 野生型甘露聚糖酶及其几种突变型甘露聚糖酶的预测三维结构的比较
6.3 本章主要结论
第七章 嗜碱芽孢杆菌N16-5 碱性β-甘露聚糖酶的应用研究
7.1 材料与方法
7.1.1 菌种及酶的制备
7.1.2 酶法制备甘露寡糖的工艺
7.1.3 压裂液破胶评价
7.2 结果与讨论
7.2.1 酶法制备甘露寡糖小试工艺的研究
7.2.2 甘露寡糖酶法制备工艺的放大研究
7.2.3 石油压裂液的酶法破胶试验
7.3 本章主要结论
论文的主要结论、创新点及展望
参考文献
致谢
攻读博士论文期间取得与本论文相关的成绩
发布时间: 2006-07-20
参考文献
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