H5N1禽流感病毒HA和NA部分蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

论文摘要

禽流感（avian influenza，AI）是A型流感病毒引起的禽类感染疾病综合征，其临床表现包括亚临床感染、中轻度的呼吸系统疾病、产蛋下降和严重的致死性疾病。由H5N1亚型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza，HPAI）是近几年来在许多国家流行、给家禽养殖业带来巨大经济损失、而且威胁到人类的健康和安全的一种烈性传染病。AIV的快速检测技术是有效控制AI流行的检测手段和重要前提，为此我们进行了该研究。本试验参照GenBank公布的禽流感病毒H5N1亚型血凝素（hemagglution HA）和神经氨酸酶（neuramindase NA）基因的核苷酸序列，设计HA基因的5′端第123～870位脱氧核苷酸和NA基因的5′端第417～1362位脱氧核苷酸特异性引物，以1株H5N1亚型禽流感病毒A／Swine／Fuiian／03 RNA为模板，通过反转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）方法，扩增了HA（核苷酸123～870位）和NA（核苷酸417～1362位）基因cDNA。将该片段克隆测序后定向插入到原核表达载体pET-his中，构建原核表达载体pET-HA和pET-NA。阳性质粒转化宿主菌BL21（DE3），经IPTG诱导，表达了HA基因和NA基因，重组蛋白以包涵体的形式存在。通过改变IPTG的浓度和诱导时间，确定了表达HA基因和NA基因的最佳诱导条件：在37℃时，用终浓度为0.5mmol／L的IPTG，诱导时间3h。用镍柱分离纯化得到纯化的重组蛋白。以纯化的表达产物作为诊断抗原建立了检测H5N1亚型AIV抗体的间接ELISA方法。结果表明，HA抗原的最佳包被浓度为320ng／孔，血清最佳稀释倍数为1：10，NA抗原最佳包被浓度为118ng／孔，血清最佳稀释倍数为1：10。对该方法进行了特异性试验、敏感性试验、重复性试验和相关性试验，结果表明这种检测AIV血清抗体的间接ELISA方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点，为H5N1亚型禽流感检测试剂盒的研制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 禽流感病毒分子生物学特性及其检测技术的研究进展
• 1 禽流感病毒的分子生物学特性
• 1.1 病毒的结构
• 1.2 病毒基因的转录、复制与表达
• 1.3 禽流感病毒的遗传变异
• 1.4 AIV毒力的分子生物学基础
• 1.5 AIV宿主特异性的分子生物学基础
• 2 AIV检测技术的研究进展
• 2.1 病原的分离和鉴定
• 2.2 血清学诊断技术
• 2.3 禽流感的分子生物学诊断
• 第二章 H5N1亚型禽流感病毒HA和NA部分蛋白的原核表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 HA和NA基因的RT-PCR结果
• 2.2 HA和NA基因酶切鉴定结果
• 2.3 PET-his-HA和PET-his-NA表达
• 2.4 PET-his-HA和PET-his-NA表达示意图和纯化图
• 2.5 BCA法对重组PET-his-HA和PET-his-NA蛋白定量测定的结果
• 3 分析与讨论
• 第三章 检测H5N1亚型禽流感抗体间接ELISA方法的建立
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 抗原最佳包被浓度及待检血清最佳稀释度的筛选
• 2.2 ELISA反应程序
• 2.3 重复性试验
• 2.4 特异性实验
• 2.5 HA交叉试验
• 2.6 NA交叉试验
• 2.7 HA-ELISA与HI试验的相关性
• 2.8 HA灵敏度试验
• 3 讨论与总结
• 结论
• 参考文献
• 英文缩写词表
• 致谢
• 作者简历及硕士期间发表的论文