论文摘要
目的一、探索出建立稳定EGFP（enhanced green fluorescent protein）标记的人肝癌Hepg-2细胞裸鼠皮下移植瘤模型,尝试对肿瘤生长进行活体荧光成像观察,比较两种转染方法对建立稳定模型的可行性。利用光学分子成像实现无创、实时和连续观察肿瘤的生长;二、初步研究人重组内皮抑素（恩度）（本论文简称内皮抑素）在体外对人肝癌Hepg-2细胞和人脐静脉内皮细胞的作用,结合上述移植瘤模型,观察内皮抑素及联合细胞周期特异性化疗药物氟尿嘧啶（flurouracil,5-Fu）对人肝癌Hepg-2细胞移植瘤裸小鼠皮下移植瘤的作用。方法:一、分别利用脂质体和含绿色荧光蛋白的慢病毒载体转染EGFP入人肝癌HEPG-2细胞,结合G418梯度浓度筛选和用分选流式细胞技术选择出稳定转染并能使EGFP长期稳定表达的方法,将EGFP标记的HepG-2人肝癌肿瘤,接种植裸鼠背部皮下建立移植瘤模型,并在不同时间对裸鼠活体成像,观察肿瘤的变化;二、在体外用cck-8检测及流式细胞技术研究内皮抑素对HepG-2作用,并验证其对人脐静脉内皮细胞的作用。用前述建模方法方法在20只裸鼠上建立EGFP标记的裸鼠移植瘤模型,7天后分组随机分成A、B、C、D四组,每组5只,A为阴性对照组生理盐水0.5ml/只/d,B组单独内皮抑素治疗组1.5 mg/kg/d,C组内皮抑素联合5-Fu化疗组,内皮抑素治疗1.5 mg/kg/d同时5-Fu 20mg/kg/d,D组单独5-Fu化疗组,5-Fu 20mg/kg/d,均为腹腔内注射,d1-d7。每隔3天在光学活体成像仪下进行活体成像,观察荧光团块变化同时传统方法测量肿瘤体积,给药7天后比较各组抑瘤率,肿瘤病理HE染色,免疫组化检测微血管计数（microvessle density,MVD）及VEGF表达情况。结果:两种转染方法均可以成功转染EGFP基因入HepG-2细胞,但只有慢病毒转染结合流式细胞分选可以使EGFP在HepG-2细胞稳定长期表达。在建立的移植瘤模型上,通过荧光活体成像连续观察到肿瘤的生长变化,药物治疗后观察到不同组荧光团块大小不同,病理组织切片HE染色证实活体荧光成像看到的荧光团块为肝癌组织,模型成功建立。cck-8检验结果显示药物作用24h,单独内皮抑素仅在100μg/ml的剂量时对HepG-2细胞在体外有轻度杀伤作用,细胞死亡率20.7%,在其余浓度无明显杀伤作用;作用48h,内皮抑素在50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml对HepG-2均有一定杀伤作用,细胞凋亡率分别为20.8%,46.3%,15.8%;在各时间段和浓度的内皮抑素对HepG-2杀伤作用显著小于相应内皮抑素+5-Fu组（P＜0.05）;流式细胞技术检验100μg/ml浓度内皮抑素诱导HepG-2凋亡的作用,结果显示内皮抑素100μg/ml作用于HepG-2细胞24h及48h,细胞凋亡率分别为为26.4%、21.1%（对照组为5.1%）;内皮抑素100μg/ml在48小时对人脐静脉内皮细胞有诱导凋亡作用,凋亡率为19.5%（对照11.7%）。联合内皮抑素和5-Fu化疗,对于人肝癌HepG-2细胞裸鼠移植瘤抑瘤率高于单独内皮抑素和单独5-Fu化疗（P＜0.05）,单独内皮抑素治疗对于人肝癌HepG-2细胞裸鼠移植瘤也有一定抑瘤作用。内皮抑素可以减低HepG-2人肝癌裸鼠皮下移植瘤肿瘤MVD及减少VEGF表达。结论:1.用慢病毒转染结合流式细胞仪分选可以获得稳定长期表达EGFP的人肝癌HepG-2细胞,相对于脂质体转染,方法简单,周期短,效率高。2.可以利用活体荧光成像仪活体无创、活体、连续、实时观察表达EGFP的HepG-2肝癌裸鼠皮下移植瘤模型肿瘤的生长变化及对药物的治疗反应。该模型的建立方法可靠,简单,可重复。3.内皮抑素对人肝癌HepG-2细胞及脐静脉内皮细胞有一定的诱导凋亡作用,但并非在所有浓度和作用时段,联合内皮抑素和5-Fu化疗对于人肝癌HepG-2细胞裸鼠移植瘤抑瘤率显著高于单独内皮抑素和单独5-Fu化疗,两种药物有协同作用。单独内皮抑素治疗对于人肝癌HepG-2细胞裸鼠移植瘤有一定抑瘤作用,内皮抑素可以减少HepG-2人肝癌裸鼠皮下移植瘤肿瘤微血管密度及VEGF表达。