pQE30-组合酸性肽基因的表达和纯化研究

论文摘要

背景与目的:人口老龄化是全世界面临的一大难题,根据世界卫生组织发布的最新统计数据,到2050年,全球60岁以上人口比例将从2006年的约11%增至22%。而我国截止到2003年60岁以上的人口已超过1.32亿,占全国总人口的10%,已经进入老龄化社会,一个庞大老年群体将会对社会经济和文化带来巨大的影响。因此,为老年人口迅速增长的社会做可持续发展准备,老年疾病的防治刻不容缓。阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）是一种发生于老年和老年前期最常见的以进行性痴呆为特征的神经系统退行性变性疾病。其主要临床症状表现为进行性学习记忆减退,认知障碍,个性改变及皮层分离症,自制力和理解力丧失,晚期则为记忆力完全丧失,语言及行为能力丧失。病程一般为十年左右,最后发展成严重痴呆以至植物人状态。AD的主要病理特征为老年斑（SP）,神经元纤维缠结（NFT）,神经元丢失。其病因和发病机制尚不完全清楚。由于缺乏有效的早期诊断方法和治疗手段,已成为继心脏病,癌症,中风之后第4位的死因,成为许多发达国家和发展中国家的主要卫生保健和社会问题之一。由于痴呆病人对社会和家庭带来的严重的负担,因此,研究AD,减少AD发病率和改善病人生活质量是一紧迫的课题。目前,AD的病因尚未完全了解,其发病机制非常复杂,所以一直以来,其治疗相当棘手。酸性肽（Acidic peptide,AP）是本实验室从牛脑中分离出的,广泛存在于动物中枢神经系统内的一种小分子生物活性肽。经过一系列研究证明酸性肽对AD模型大鼠具有良好的治疗作用,其作用机理是:①酸性肽具有抗氧化作用;②酸性肽能增加脑内蛋白质的合成,促进大脑损伤的修复;③酸性肽能促进Bcl-2基因表达,抑制Bax基因表达并抑制一氧化氮（NO）,β淀粉样蛋白和N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体的产生,从而抑制神经细胞的凋亡。④酸性肽能够促进星形胶质细胞合成和释放神经生长因子（NGF）和脑源性生长因子（BDNF）,从而促进星形胶质细胞增殖,存活率增加,对星形胶质细胞和神经元的生长存活有营养和保护作用。⑤酸性肽为小分子肽,无抗原性,能够通过血脑屏障。但是,由于直接从动物大脑提取获得的神经酸性肽可能会携带疯牛病因子或病毒,无法直接应用于临床治疗。为此,本课题在应用基因克隆技术合成了组合酸性肽基因并在大肠杆菌中成功表达的研究工作基础上,对其进行了分离和纯化,以便生产出安全可靠的非动物源性的酸性肽,为临床治疗老年痴呆病提供安全有效的药物。方法:以终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导含pQE30-组合酸性肽基因克隆的宿主菌M15（pREP4）表达融合蛋白,离心收集细菌,利用超声裂解和加热冷冻裂解两种方法裂解细菌,将裂解后的菌液经冷冻浓缩成粉末,溶解成10%的溶液,过滤后取上清液,分别用葡聚糖凝胶G-25,G-50,G-75三种凝胶进行纯化分离,收集洗脱液,并用SDS-PAGE凝胶电泳分析靶蛋白的纯化分离情况,根据电泳结果将样品做氨基酸测定。结果:1.10%的细菌裂解液经交联葡萄糖凝胶G-50上柱纯化后,分离His-组合酸性肽融合蛋白的效果最好。2.经葡聚糖凝胶G-50纯化后分部收集的洗脱液经.SDS-PAGE凝胶电泳分析,其中40-50管中所含蛋白质成分最为单一。3.将40-50管洗脱液做氨基酸鉴定,证明所含氨基酸主要为谷氨酸,即主要为组合酸性肽的融合蛋白。结论:本试验从pQE30-组合酸性肽基因克隆的宿主菌M15（pREP4）在经IPTG诱导后所表达的多种蛋白质中,利用葡聚糖凝胶G-50成功地纯化分离出了分子量约为4.5KD的His-组合酸性肽的融合蛋白,并经过氨基酸测定证实。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文 pQE30-组合酸性肽基因的表达和纯化研究
• 1.前言
• 2.材料与方法
• 3.实验方法
• 4.结果
• 5.讨论
• 6.小结
• 参考文献
• 综述 基因工程蛋白质药物分离纯化
• 参考文献
• 英文缩写词索引
• 致谢