融合蛋白毒性分析与转基因抗虫棉载体构建

论文摘要

病虫害对农业生产活动造成了极大影响,不但降低农作物的产量和质量,对农民的积极性也造成了很大地影响。化学农药的应用在一定程度上对病虫害的防治起到一定的作用,但是随着化学农药的广泛使用,对环境保护和生态平衡造成极大地破坏,这些弊端受到人们的重视,环境友好型的生物防治应运而生。自日本学者石渡从染病家蚕中第一次分离得到苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）以来,人们对抗虫基因不断地有新的发现,并将其作为转基因抗虫棉的材料应用于转基因作物。随着转基因抗虫作物的广泛种植,昆虫对单—的杀虫基因逐渐产生了抗性；抗性产生的的主要原因是杀虫蛋白由原毒素到活性蛋白的活化过程发生变异或肠道受体细胞发生变异。将作用机制不同的杀虫基因转入植物培养多价抗虫作物是解决这一问题的主要策略。本研究依据陆地棉（Gossypium hirsutum）使用密码子的偏爱性,对编码Vip83（营养期杀虫蛋白）的vip83和Cry2A、Cry9C（晶体杀虫蛋白）的cry2A、cry9C分别进行密码子优化,并合成优化之后的基因,分别命名为vip83s、cry2As、cry9Cs。然后利用编码肠激酶识别序列GATGATGATGATAAG)分别将营养期杀虫蛋白基因和晶体杀虫蛋白基因融合为一个编码框,构建两个二价的基因vip83s-cry2As、vip83s-cry9Cs。为了验证融合蛋白在体外的杀虫活性,分别将cry2As、cry9Cs、vip83s、vip83s-cry2As和vip83s-cry9Cs五个基因与原核生物表达载体pGEX-6p-1构建重组载体pGEX-6p-cry2As、pGEX-6p-cry9Cs、pGEX-6p-vip83s、pGEX-6p-vip83-scry2As和pGEX-6p-vip83s-cry9Cs,并将这些质粒在E.coli BL21（DE3）中重组表达；对表达产物分别用缓冲液PBS buffer （pH 7.0）和Gly-NaOH buffer （pH 10.0）溶解,并进行SDS-PAGE分析表明。结明表明Cry2A、Cry9C、Vip83s-Cry2As和Vip83s-Cry9Cs在PBS buffer中均不可溶,Vip83蛋白的溶解性为40%；而在Gly-NaOH buffer中Cry2A、Cry9C、vip83s-cry2As和vip83s-cry9Cs有50%的溶解性,Vip83蛋白的溶解性为65%。肠激酶切割分析表明融合蛋白Vip83-Cry2A在体外能够被正确的切割为Vip83和Cry2A两个部分。进一步利用小菜蛾对重组表达的三个杀虫蛋白进行生物测定,结果表明Vip83-Cry2A的杀虫活性比Vip83和Cry2A明显提高。Vip83-Cry9C的杀虫活性也比单独表达的Vip83和Cry9C蛋白的活性高；为进一步应用于二价转基因抗虫棉花的分子育种奠定基础。将cry2As和vip83s-cry2As与植物载体pCAMBIA2300分别构建重组质粒,并利用pG4AB质粒上的强启动子、（?）序列、PolyA和强终止子序列,构建成的载体分别为PC35SΩAN-2A和pC35SΩAN-V-2A,用其作为杀虫蛋白在植物体内的表达载体,以促进高含量杀虫蛋白的在植物中的表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 Bt杀虫晶体蛋白及其基因
• 1.1.1 Bt的生物学特性
• 1.1.2 杀虫晶体蛋白的结构
• 1.1.3 Bt杀虫晶体蛋白及其基因的分类
• 1.1.4 杀虫晶体蛋白的杀虫机制
• 1.1.5 昆虫对晶体蛋白产生抗性的机理
• 1.2 Bt营养期杀虫蛋白及其基因
• 1.2.1 Vips的发现
• 1.2.2 Bt营养期杀虫晶体蛋白及其基因的分类
• 1.2.3 杀虫晶体蛋白的杀虫机制
• 1.3 杀虫基因在农业生产上的简史、商品化生产
• 1.3.1 Bt杀虫蛋白的应用简史
• 1.3.2 全球转基因作物商品化现状
• 1.3.3 中国的转基因研究及商品化现状
• 1.3.4 昆虫对转Bt作物抗性的产生及其对策
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 昆虫
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5. 常用溶液
• 2.1.6 仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 分子生物学常规操作
• 2.2.2 棉花基因偏爱密码子的优化
• 2.2.3 重组表达质粒的构建
• 2.2.4 重组表达菌株的构建
• 2.2.5 外源基因的诱导表达
• 2.2.6 肠激酶鉴定
• 2.2.7 单价与双价毒性蛋白的生物学活性测定
• 2.2.8 单价植物表达载体的构建
• 2.2.9 双元载体的构建
• 3. 结果与分析
• 3.1 优化前后碱基序列的分析
• 3.2 优化前后的基因序列比对分析
• 3.3 原核生物重组表达载体的构建与鉴定
• 3.4 Cry2A、Cry9C、Vip83和Vip83-Cry2A、Vip83-Cry9C蛋白在重组DE3菌株中的表达
• 3.5 Vip83-Cry2A蛋白的肠激酶酶切鉴定
• 3.6 重组菌株的生测活性的分析
• 3.7 植物表达载体的构建
• 3.7.1 单价植物表达载体的构建与鉴定
• 3.7.2 双价植物表达载体的构建与鉴定
• 4. 讨论
• 参考文献
• 附录
• 1. cry2A与cry2As核苷酸序列比对表
• 2. cry9C与cry9Cs核苷酸序列比对表
• 3. vip83与vip83s核苷酸序列比对表
• 4. 在读期间已发表文章
• 致谢