论文摘要
1猪链球菌1、2、7和9型的二重PCR方法的建立以猪链球菌特异性的谷氨酸脱氢酶基因（gdh）及猪链球菌型特异性的荚膜多糖合成相关的基因（cps1J，cps2J，cps7H，cps9G）为目的基因，设计合成五对引物，分别扩增1型的gdh和cps1J，2型的gdh和cps2J，7型的gdh和cps7H，9型的gdh和cps9G，建立了猪链球菌1、2、7和9型的二重PCR方法，并用猪链球菌所有35个血清型的参考菌及1株B群链球菌和1株C群链球菌验证了1、2、7和9型二重PCR方法的特异性。对1、2、7和9型二重PCR扩增产物进行克隆并序列分析表明，其扩增产物为特异性的目的基因片段；用菌落计数法对二重PCR进行了敏感性试验，结果1、2、7和9型的二重PCR都在100cfu时仍能扩增出目的基因片段；12株已知的2型菌用2型的二重PCR方法进行了检测，其检测符合率为100％；10株疑似的猪链球菌用1、2、7和9型的二重PCR进行了检测，结果发现其中的2株菌为7型猪链球菌，2株菌为9型猪链球菌；同时，在长达一年的时间内定期进行了1、2、7和9型二重PCR试验，结果表明，1、2、7和9型的二重PCR具有很好的稳定性。2用1、2、7和9型的二重PCR方法对重庆地区猪链球菌进行检测和鉴定在重庆市的20个区县随机采取了1360份健康猪的扁桃体和116份病猪组织，结合血清学方法等方法，用所建立的猪链球菌1、2、7和9型的二重PCR方法对其进行了猪链球菌的检测。从1360份健康猪扁桃体中检测鉴定出猪链球菌224株，其检出率达到16.5％。224株猪链球菌中，2型菌有5株，分别来自3个区县；7型菌有4株，分别来自4个区县；9型菌有4株，分别来自2个区县；未能检测到1型猪链球菌：210株菌未能进行定型。而从116份病猪组织中检测鉴定出了8株猪链球菌，分别来自4个区县，但不是1、2、7和9型猪链球菌。本次试验中，检测到1株1／2型猪链球菌，为我国首次报道。3猪链球菌2、7和9型重庆分离株毒力因子mrp和epf的检测和其中的一些新发现溶菌酶释放蛋白（MRP，mrp）、胞外因子（EF，epf）被认为是猪链球菌中两个至关重要的毒力因子，这两种毒力因子有时也表现为MRP*（大分子量MRP，mrp*）、MRPs（小分子量MRP，mrps）、EF*（大分子量的EF，epf*），而不同分子量的MRP和EF也与菌株的毒力或致病性的不同有较强的相关性。对包括重庆分离株在内的共26株猪链球菌2型菌（25株从猪上分离，1株从人上分离）进行了毒力因子mrp和epf的检测，结果发现大部分分离自发病猪（包括病人）上的2型菌株均为mrp+epf+，只有菌株SH0401为mrp+epf*，而大部分从健康猪扁桃体分离的2型菌为mrp-epf+（即表现为缺失毒力因子mrp），只有菌株CQTN63为mrp+epf+，另外，2型参考菌株735为mrp-epf*。对其中10株菌的epf进行了克隆并序列分析，发现它们的核苷酸同源性都在99％以上。对菌株SH0401和735的epf*进行了克隆，其序列与GenBank公布的菌株1890的序列相一致。对包括重庆分离株在内的共15株2型以外（包括1、1／2、7、9型）的菌株进行了毒力因子mrp的检测，结果首次发现三株7型菌（CQBB214、CQWZ10、8074）和一株1／2型菌（CQFL42）均能扩增出474bp的基因片段，这一结果在国内外均未见相关报道。对扩增出的474bp基因片段克隆并序列分析发现，其序列中的465bp与2型菌的mrp（1148bp）几乎是一致（同源性达到了99％以上），但2型菌却比其多出了670bp的一段序列。另外，还发现一株7型菌BJ09为mrp*（2000bp左右），对其序列分析表明，其序列中的800bp与2型菌的mrp几乎一致（同源性达到了98％以上），但其800bp以后的序列则与2型菌的mrp序列完全不同。同时还对这15株菌进行了毒力因子epf的检测，结果没有检出epf。4猪链球菌谷氨酸脱氢酶（GDH）基因的克隆和序列分析有研究表明，猪链球菌谷氨酸脱氢酶（GDH）既是一种保护性抗原，又能作为一种诊断性抗原，且与其它蛋白相比，GDH有很低的点突变率和高度保守等优点。因此，GDH有着越来越广阔的应用前景。本试验对44株各型（包括1、2、1／2、7、9、4、19、27、30、31型和1株未知型）猪链球菌的谷氨酸脱氢酶基因（gdh）开放阅读框（1347bp）进行了克隆并序列分析，结果发现，所有的2型菌的gdh的同源性都在99％以上，而各型之间的同源性大多也能达到94％以上。同时还发现2型以外其他型猪链球菌的gdh在162、279、534、898、916、978、981、991、1011、1023、1068、1077、1083、1098、1104、1107、1137、1158和1224位处的核苷酸发生了突变，表明这些位点上核苷酸的突变与猪链球菌血清型的改突变有明显的相关性，也说明这些位点是重要的突变位点。同时发现gdh的978～1023位点和1060～1120位点是其两个高变区域。44株菌的氨基酸序列的同源性都达到了97％以上，并具有GDH1型的典型保守序列。与2型相比，其他型的GDH氨基酸序列在3个位点都发生了改变，分别是299位点（由S变为A）、305位点（由K变为E）、330位点（由K变为E），说明这几个位点上的氨基酸改变与血清型的改变有很大的相关性。