胶原蛋白肽生物功能材料的研究与开发

论文摘要

近年来随着生物医学与生物技术的突破性研究发展，发现了胶原蛋白肽在人体内有重要作用，其中，最具里程碑意义的是发现胶原蛋白肽有着自己的特征和性能。本论文将复合酶降解的胶原蛋白肽为研究方向，试图建立一套系统的研究方案：对胶原蛋白肽的复合酶提取工艺、分离纯化、检测技术以及相关理论进行探讨；并对氨基酸序列和三维立体结构特点以及胶原蛋白肽的一些功能和性质进行分析和研究；同时，对金属肽的合成和胶原蛋白肽的应用进行了初步探索。用复合酶去酶解皮革下脚料铬革屑，利用酸性蛋白酶3350、碱性蛋白酶2709、中性蛋白酶AS1.398、Protamex、Flavourzyme等水解皮革，提取其中的胶原蛋白肽。选择和影响酶作用的各种影响因素表明：先用CaO进行前处理，再用碱性蛋白酶2709和中性蛋白酶AS1.398的协同作用进行酶解，将水解液进行过滤后，脱铬并浓缩干燥是一条有效的工艺途径。产物的检验结果证实：粗蛋白含量≥90％。研究还提出了用阿贝折射仪测定溶液折射率来控制水解程度，并从原理上对其可行性进行了论证，试验结果给予了证实。用上述产物——水解胶原蛋白肽作为合成肽铜的原料，研究得到的工艺条件为：反应液pH=11，常温反应20 min；红外光谱法鉴定了目标产物结构的正确性；X-衍射和核磁技术对金属肽进行了测定，并表征了其三维空间结构。设计了毛细管层析质谱法结合等电点聚焦法以及数据库搜寻蛋白质组的联机设备，即多维分离鉴定技术，使得研究工作简单易行。设备所使用的样品及缓冲溶液用量可微型化，样品量减少到100μL以下，缓冲液的用量仅为5～10mL，此项技术更有利于生化样品快速准确的检测。对分离纯化后的胶原蛋白肽进行了序列测定和空间立体结构的表征。用现代分析手段对胶原蛋白肽三维立体图谱、片断图谱和氨基酸组成以及结构等进行了测定和研究。直观地观察了氨基酸的倾向结构和底部结构、卡通环和主骨架、二级结构和末端、金属化合物的配体结构、胶原肽的晶体结构、水合结构以及多聚体结构等。对胶原蛋白肽的功能和性质进行了研究和讨论。在胶原蛋白肽中引入硫醇基，使二硫键控制溶解肽在DBC中的活动成为可能。DBC-溶解肽共轭体证实了溶解肽的活性；其在制备后至少3个月内稳定：受pH值变化的影响，其活性在热处理后比自由酶稳定；pH=6.3时，活性最强，而天然溶解肽的pH=9.0。研究发现，胶原蛋白肽浓度大于0.5mg·mL-1时，在465nm处的荧光强度有突跃：继续增大浓度，荧光强度越来越大。当胶原蛋白肽浓度增大并超过0.15mg·mL-1时，体系具有较高的粘度，进一步证实了胶原蛋白肽在水溶液中的聚集特性。采用高效液相色谱法，优化流动相的组成，成功地将16种目标肽与其它杂质分离。同时成功地分析了结构相似的小分子肽。以三氟乙酸为流动相和酸性调节剂，考察乙腈-水不同配比对肽分离的影响，流动相乙腈含量在20％和流速在1.0 mL·min-1，可达到分离的目的。目标肽纯度范围23.78％～89.90％，保留时间3.35～27.15min。胰岛素A链和胰岛素B链标准品测定结果为：主峰纯度分别为79.98％和87.69％，而产品的标示纯度为80.11％和89.34％，这表明本方法的分离效率较好。建立了一种有效分离小分子肽的Tricine-SDS-PAGE的方法。调整胶中聚丙烯酰胺胶的组成，让致密胶中丙烯酰胺和双丙烯酰胺的交联度为5.5％，并加入38％的尿素，可以有效地分离≤1kD的肽链，此方法明显优于常规的SDS-PAGE和现有的Tricine-SDS-PAGE方法。毛细管电泳—十二烷基硫酸钠（CE-SDS）蛋白设备用于亚胶原蛋白肽的动力学筛选分离。最佳条件为：使用36cm（或24cm）×50um的无涂层毛细管，电泳注射电压为10kV╱10s，操作电压15kV毛细管温度20℃。在220nm处紫外检测，发现此方法有很好的重现性，且实验数据均呈线性关系。胶原蛋白肽的动力学筛选毛细管电泳（DSCE）图在数值上、相关含量上与用库马西着色的SDS-PAGE凝胶扫描结果相似。本项目的产品经分析检测，富含19种氨基酸，蛋白质含量超过90％。应用研究表明：酶解提取的分子量为3000～4000Da的胶原蛋白肽，对皮肤和毛发有明显的保湿、抗氧化、增加弹性和紧实性的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述及研究问题的提出
• 1.1 生物活性肽
• 1.1.1 生物活性的应用价值
• 1.1.2 肽与肽营养学的发展历史
• 1.1.3 生物活性肽的功能营养作用
• 1.1.4 活性肽显著的生物功能
• 1.2 胶原蛋白与胶原蛋白肽
• 1.2.1 胶原蛋白与胶原蛋白肽简介
• 1.2.2 胶原肽与胶原蛋白的关系
• 1.2.3 胶原蛋白肽生物医学材料用途
• 1.3 胶原蛋白肽的研究
• 1.3.1 提取胶原蛋白肽的方法
• 1.3.2 提取与纯化
• 1.3.3 浓缩、干燥及保存
• 1.3.4 蛋白质组与鉴定
• 1.4 研究问题的提出
• 第二章 复合酶法提取胶原蛋白肽
• 2.1 实验部分
• 2.1.1 试剂与仪器
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 预处理的影响
• 2.2.2 复合酶水解胶原蛋白肽的研究
• 2.2.3 碱性蛋白酶2709水解工艺的优化
• 2.2.4 复合酶水解效果的研究
• 2.2.5 碱性水解与酶水解的比较
• 2.2.6 后处理的影响
• 2.3 本章总结
• 第三章 胶原蛋白肽的分离
• 3.1 实验
• 3.1.1 试剂与试样
• 3.1.2 缓冲液和标准的配制
• 3.1.3 仪器装置
• 3.2 分离仪器简介
• 3.2.1 二维胶体电泳（2D-GE）
• 3.2.2 二维液相层析
• 3.2.3 等点聚焦电泳/液相层析（IEF-HPLC）
• 3.2.4 分离方式
• 3.2.5 毛细管液相层析质谱
• 3.2.6 等电点聚焦电泳实验组装
• 3.2.7 实验步骤
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 10个区段之等电点聚焦装置分离标准蛋白多肽
• 3.3.2 10个区段之等电点聚焦装置分离样品
• 3.3.3 20个区段之等电点聚焦装置分离样品研究
• 3.3.4 50个区段之等电点聚焦装置分离样品蛋白多肽
• 3.3.5 再现性探讨
• 3.4 本章总结
• 第四章 胶原蛋白小肽和相似肽的分离及其纯化技术
• 4.1 实验部分
• 4.1.1 试剂与仪器
• 4.1.2 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 小肽分离技术
• 4.3.2 相似肽分离技术
• 4.4 本章总结
• 第五章 胶原蛋白肽和氨基酸的定量分析与研究
• 5.1 实验
• 5.1.1 试剂
• 5.1.2 仪器
• 5.1.3 测试方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 胶原蛋白肽定量的BCA法
• 5.2.2 胶原蛋白肽中氨基酸的衍生法测定
• 5.3 本章小结
• 第六章 酶解胶原蛋白肽的肽谱和结构分析
• 6.1 实验部分
• 6.1.1 材料、仪器与实验方法
• 6.2 实验结果与讨论
• 6.2.1 胶原蛋白肽的HPLC分析
• 6.2.2 液质联用分析胶原蛋白肽的肽段序列结构
• 6.2.3 X-衍射的三维立体结构分析
• 6.3 本章小结
• 第七章 胶原蛋白肽的功能与性质
• 第一节 酶与生物活性胶原蛋白肽结合的机理研究
• 7.1 实验部分
• 7.1.1 试剂
• 7.1.2 原料与方法
• 7.2 结果与讨论
• 7.2.1 胶原蛋白肽硫醇盐与溶解肽吡啶二硫衍生物的反应
• 7.2.2 胶原蛋白肽─溶解肽共轭体的最佳pH值
• 7.2.3 胶原蛋白肽─溶解肽共轭体的热稳定性
• 7.3 小结
• 第二节 毛细管电泳法研究胶原蛋白肽的特性
• 7.1 实验部分
• 7.1.1 试剂与仪器
• 7.1.2 实验方法
• 7.2 结果与讨论
• 7.2.1 胶原蛋白肽特征分析
• 7.2.2 胶原蛋白肽不规则的迁移时间探讨
• 7.3 小结
• 第三节 胶原蛋白肽水溶液的聚集状态
• 7.1 实验部分
• 7.1.1 试剂与仪器
• 7.1.2 实验方法
• 7.2 结果和讨论
• 7.2.1 胶原蛋白肽的紫外吸收光谱表征
• 7.2.2 不同浓度胶原蛋白肽的荧光发射光谱表征
• 7.2.3 胶原蛋白肽的稳态偏振研究
• 7.3 小结
• 第八章 肽铜的合成与研究
• 8.1 实验部分
• 8.1.1 主要试剂与仪器
• 8.1.2 实验方法
• 8.2 结果与讨论
• 8.2.1 复合氨基酸整全铜的红外光谱分析
• 8.2.2 胶原蛋白肽铜的甲醛滴定分析
• 8.3 本章小结
• 第九章 胶原蛋白肽的应用研究
• 9.1 实验部分
• 9.1.1 材料与方法
• 9.1.2 结果与讨论
• 9.1.3 本章总结
• 结论与创新
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 致谢
• 附录一
• 附录二
• 附录三
• 附件四
• 附录五
• 附录六