表面等离子体激元共振用于药物/蛋白相互作用和DNA放大检测

论文摘要

本文回顾了表面等离子激元共振（SPR）传感器的发展历史并简单介绍了SPR在大量生物体系中的应用。由于SPR传感器不需要标记就可以直接测量生物分子间的相互作用，使其成为研究生物分子作用表征和定量的重要手段。与其他技术如酶、放射标记等相比较，SPR技术以其快速、高灵敏度的特性被广泛的应用到生物分子机制的研究中去，包括蛋白相互作用，抗原／抗体作用，配体／受体相互作用等。本论文使用SPR与流动注射（FI）联用装置，研究了药物与蛋白的相互作用和新的DNA序列放大检测两个不同体系。通过层层自组装方法，将11-巯基十一酸（MUA）固定在金膜表面上，再利用NHS／EDC对羧基的活化将牛血清白蛋白（BSA）固定到MUA上，形成单分子层的BSA膜，未反应的MUA分子的活性基团再用氨基乙醇（AE）进行封闭，使形成的SPR芯片表面只裸露BSA的活性基团。流动注射药物双氯酚酸钠（DFS），当DFS分子与BSA相互作用时，产生SPR信号变化。研究表明不同浓度DFS浓度为50～300μmol／L时，SPR的信号变化与浓度呈现良好的线性关系。说明在一定条件下，BSA与DFS有相互作用，对了解药物的特性有一定的理论意义。另外实验设计的BSA芯片，可以用来研究其它药物与BSA的相互作用，这一模板在研究药物-蛋白作用中具有通用性。实验通过形成“三明治”结构多层单分子膜，在检测探针寡核苷酸末端标记有生物素（Biotin），再通过抗生素-过氧化物酶共聚体（SA-HRP）将酶修饰到DNA芯片表面，当4—氯萘酚（CN）和双氧水混合液与过氧化物酶相遇时，形成相应的沉淀，覆盖在自组装分子层上。实验采用FI-SPR方法测定，由于沉淀的生成使SPR信号急剧变化，放大，得到很低的检测限。该实验可重复且选择性高，得到的检测限为10 fmol／L。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 表面等离子体激元共振（SPR）的发展历史和研究现状
• 1.2 SPR的理论基础
• 1.3 SPR传感器的特点
• 1.3.1 样品无需标记，对样品无损
• 1.3.2 灵敏度高，无背景干扰
• 1.3.3 能进行现场实时动态分析
• 1.3.4 可现场模拟观测
• 1.3.5 具备定量与尺寸分析能力
• 1.3.6 通用性与选择性兼备
• 1.4 SPR生物传感器的应用
• 1.4.1 生物分子的相互作用
• 1.4.2 动力学的研究
• 1.4.3 反应机理的研究
• 1.5 本论文的主要工作内容
• 第二章 利用FI-SPR研究DFS与BSA的相互作用
• 2.1 简介
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 药品与试剂
• 2.2.2 仪器
• 2.2.3 溶液的配制
• 2.2.4 玻片处理和金膜制备
• 2.2.5 实验所用SPR仪装置图
• 2.2.6 实验步骤
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 流动组装的SPR信号图
• 2.3.2 控制实验
• 2.3.3 不同浓度DFS的SPR信号图
• 2.4 结论
• 第三章 酶-沉淀放大用于FI-SPR对DNA的超痕量检测及序列分析
• 3.1 简介
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 药品与试剂
• 3.2.2 仪器
• 3.2.3 溶液的配制
• 3.2.4 俘获探针的固定
• 3.2.5 DNA的杂化及和酶分子层的形成
• 3.2.6 样品的引入和酶放大沉淀的生成
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 实验所用的SPR装置图
• 3.3.2 实验方案示意图
• 3.3.3 流动注入靶点DNA和酶标记的DNA的SPR信号图
• 3.3.4 控制实验
• 3.3.5 方法的选择性实验
• 3.3.6 SPR信号与靶点DNA浓度之间关系
• 3.3.7 升高到57℃杂化与室温25℃杂化的SPR信号图
• 3.4 结论
• 结论
• 附录1
• 附录2
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间主要研究成果