硝基苯对公鸭肝脏损伤机制的研究

论文摘要

硝基苯（NB）是一种应用广泛的重要化工有机合成原料,但同时也是环境中重要的污染物之一,并被美国环保局规定为环境中优先监测污染物。已有研究表明,NB的长期接触对人体及动植物危害极大,可以引起机体发生氧化损伤、细胞凋亡、坏死等病理变化,但目前NB的毒理学研究主要集中在哺乳动物和鱼类,对于禽类的研究较少。本试验以育成公鸭为研究对象,对其进行不同浓度NB灌胃染毒,通过对受试公鸭肝脏显微结构和超微结构的观察、细胞凋亡率、肝微粒体P450酶系的活性和含量及其相关基因表达情况、血清或/和肝脏的抗氧化功能、血清肝功能和肝脏酶组织化学的检测,研究了硝基苯对育成公鸭肝脏结构和功能,以及肝脏P450酶系、抗氧化功能和细胞凋亡的影响,并对其毒性作用机理进行了初步探讨,为全面评价NB对禽类的生态毒理效应提供科学依据。研究结果表明:1.通过剖检变化、显微和超微结构的观察,以及血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总蛋白（TP）、白蛋白/球蛋白（A/G）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、间接胆红素（IBIL）和总胆汁酸（TBA）等肝脏功能指标活性或含量的检测,说明NB能够损伤公鸭的肝脏组织;2.通过血清和肝脏抗氧化功能的检测,表明NB能够诱导公鸭肝脏组织发生氧化应激,导致谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性和还原型谷胱甘肽（GSH）含量降低,丙二醛（MDA）含量升高,并且影响肝脏中一氧化氮（NO）含量和一氧化氮合酶（NOS）活性,从而破坏机体抗氧化防御系统及清除自由基功能,造成公鸭肝脏组织发生氧化损伤,这可能是NB对肝脏的损伤机制之一;3.通过肝脏酶组织化学的检测,说明NB能够改变酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（ALP）、Mg2+激活的三磷酸腺苷酶（Mg2+-ATPase）、Ca2+激活的三磷酸腺苷酶（Ca2+-ATPase）、葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）的活性,进而影响肝脏的正常功能;4.通过TUNEL法对肝脏细胞凋亡的检测,表明NB经口染毒可以使肝脏细胞凋亡指数显著升高,诱导公鸭肝脏细胞发生凋亡,这可能是NB对肝脏损伤作用的重要诱导因素;5.通过肝微粒体P450酶系的活性及其基因表达情况的检测,显示NB能够影响肝微粒体细胞色素P450和b5的含量、NADPH-细胞色素C还原酶（CR）、氨基吡啉-N-脱甲基酶（AND）、红霉素-N-脱甲基酶（ERND）和7-乙氧基香豆素O-脱乙氧基酶（ECOD）的活性,及其相关基因CYP1A5和CYP3A37 mRNA的表达,从而干扰P450酶系的正常功能,加剧机体内的氧化损伤,说明P450酶系与机体内的氧化应激作用共同参与NB对肝脏的损伤过程。综上所述,NB可以影响公鸭肝脏P450酶系、抗氧化功能和肝组织酶活性,改变肝脏的正常生理功能,导致氧化应激的发生,并诱导肝脏细胞发生凋亡,造成肝脏组织的病理损伤,从而发挥其毒性作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 概述
• 1.2 硝基苯中毒
• 1.2.1 硝基苯中毒的临床表现
• 1.2.2 硝基苯中毒的病理学变化
• 1.3 硝基苯的毒理机制
• 1.3.1 硝基苯的代谢
• 1.3.2 硝基苯与肝脏
• 1.3.3 硝基苯与氧化应激
• 1.3.4 硝基苯与细胞凋亡
• 1.4 试验研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 主要仪器和试剂
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 NB 中毒动物模型的建立
• 2.3 样品的采集与处理
• 2.3.1 血液和肝脏样品的采集与处理
• 2.3.2 肝微粒体的制备
• 2.4 试验检测项目与方法
• 2.4.1 临床症状观查
• 2.4.2 病理学检查
• 2.4.3 肝脏功能的检测
• 2.4.4 细胞凋亡的检测
• 2.4.5 血清和肝脏抗氧化功能的检测
• 2.4.6 NO 代谢的检测
• 2.4.7 酶组织化学的检测
• 2.4.8 肝微粒体混合功能氧化酶的测定
• 2.4.9 公鸭肝脏CYP1A5 和CYP3A37 mRNA 表达的测定
• 2.5 试验数据的分析及统计
• 3 结果与分析
• 3.1 病理学检查结果
• 3.1.1 临床症状
• 3.1.2 病理剖检变化的观察
• 3.1.3 肝脏脏器系数的测定结果
• 3.1.4 肝脏病理组织学的观察结果
• 3.2 肝脏功能的检测结果
• 3.2.1 血清总蛋白含量及白/球蛋白比值的检测结果
• 3.2.2 血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性及其比值的检测结果
• 3.2.3 血清胆红素和总胆汁酸含量的检测结果
• 3.3 细胞凋亡的检测结果
• 3.4 肝脏酶组织化学的检测结果
• 3.5 抗氧化功能的检测结果
• 3.5.1 血清和肝脏中GSH-Px 活性的检测结果
• 3.5.2 血清和肝脏中SOD 活性的检测结果
• 3.5.3 血清和肝脏中MDA 含量的检测结果
• 3.5.4 血清和肝脏中CAT 活性的检测结果
• 3.5.5 血清和肝脏中GSH 含量的检测结果
• 3.6 NO 代谢的检测结果
• 3.6.1 血清和肝脏中NO 含量的检测结果
• 3.6.2 血清和肝脏中NOS 活性的检测结果
• 3.7 公鸭肝微粒体混合功能氧化酶的测定结果
• 3.8 公鸭肝脏CYP1A5 和CYP3A37 MRNA 表达的检测结果
• 3.8.1 最佳PCR 反应条件的摸索结果
• 3.8.2 公鸭肝脏β-actin、CYP1A5 及CYP3A37 基因PCR 产物鉴定结果
• 3.8.3 公鸭肝脏CYP1A5 和CYP3A37 mRNA 表达量的检测结果
• 4 讨论
• 4.1 硝基苯对公鸭病理学变化的影响
• 4.1.1 肝脏脏器系数的变化
• 4.1.2 硝基苯对公鸭肝脏显微和超微结构的影响
• 4.2 硝基苯对公鸭肝脏功能指标的影响
• 4.3 硝基苯对血清和肝脏抗氧化功能的影响
• 4.4 硝基苯对血清和肝脏NO 代谢的影响
• 4.5 硝基苯对公鸭肝脏细胞凋亡的影响
• 4.6 硝基苯对肝脏细胞组织酶活性的影响
• 2+-ATPase 和Ca²⁺-ATPase 活性的影响'>4.6.1 硝基苯对肝脏细胞Mg²⁺-ATPase 和Ca²⁺-ATPase 活性的影响
• 4.6.2 硝基苯对肝脏中ALP、ACP 和G-6-Pase 活性的影响
• 4.7 硝基苯对肝微粒体P450 活性及表达的影响
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士期间发表的学术论文