新型DNA标记技术RSAP的创建及其在辣椒遗传育种中的应用

论文摘要

辣椒（Capsicum spp.）起源于美洲热带地区,在世界各地均有栽培,我国是世界上辣椒栽培面积最大的国家。鲜食尖椒类（Capsicum annuum var. longum）品种是我国辣椒生产的主要品种类型之一,高产育种是其重要的育种目标之一。借助DNA标记技术,通过对产量相关性状的QTL定位,可实现此类性状的分子标记辅助选择,极大提高育种效率。然而目前广泛采用的基于限制性位点类的DNA标记技术均需限制性酶切环节,程序复杂,还会出现假阳性。本文提出了一种基于限制性酶切位点的新型DNA标记技术——限制性位点扩增多态性（RSAP）,该技术通过特殊的引物设计,一个简单的PCR可完成对基因组限制性位点多态性的检测,无需酶切环节。试验以辣椒为主要试材,对该技术进行了验证和优化,并在水稻和苦瓜上对其适用性做了进一步检测。为进一步评价RSAP方法的应用性及其分析效率,本文采用RSAP、SRAP和SSR标记对来自国内外10份优良尖椒自交系进行了遗传差异分析,将RSAP与其它2种标记技术的分析效率及结果进行了比较和评价。利用创建的RSAP技术,联合SRAP,以鲜食尖椒类2个优良自交系杂交产生的93株F2代为群体,构建了一张辣椒种内分子连锁图谱。基于所构建的分子图谱,结合田间调查的15个产量相关性状表型值,采用多重区间定位法开展了15个辣椒产量相关性状的QTL定位。同时将多重区间定位法和条件分析法结合起来,对不同发育时期辣椒株高的动态QTL变化进行了分析研究。试验获得如下研究结果:1.创建了一种新型DNA标记技术——限制性位点扩增多态性（RSAP）,并优化了其PCR反应体系。技术的要点为:采用2条长度均为18个碱基的引物,引物的5′端为12～14个碱基的随机序列,接着是46个碱基的限制性酶切位点序列,2条引物采用不同的限制性位点;PCR扩增的前5个循环采用35℃的退火温度,随后的35个循环采用48℃的退火温度;在25μL反应总体积中,模板DNA用量为20 ng,Mg2+浓度为2.5 mmol/L,dNTPs浓度为0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1.5 U,2个引物均为600 nmol/L;扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶分离,银染显色。RSAP方法无需酶切,比以往基于限制性位点的标记技术操作简便,并具有中等产率、稳定可靠的特点和较广泛的适用性,在水稻和苦瓜上分别获得了良好的扩增结果。2. RSAP、SRAP和SSR标记技术对10份尖椒优良自交系遗传差异的分析表明:RSAP具有比SRAP和SSR较高的位点和多态性检测能力。RSAP平均每次检测的位点数为51个,分别是SRAP和SSR的1.5倍和17倍;RSAP产生的多态性位点数为13个,分别是SRAP和SSR的1.3倍和6.5倍。基于RSAP的10个辣椒自交系间的遗传距离与基于SRAP和基于SSR的遗传距离相关性较高,分别为0.5324和0.5429。基于SRAP标记和SSR标记联合数据的聚类结果与基于RSAP的聚类结果基本一致,均将10个尖椒自交系分为3大类。这种分类结果与辣椒的杂种优势育种实践及传统基于辣椒果实特征为重要指标的分类方法相一致。3.基于251个RSAP和SRAP标记,利用JoinMap3.0软件对构建了一张包含12个大的连锁群和3个小连锁群的辣椒种内遗传图谱。该图谱包含35个RSAP标记和78个SRAP标记,共113个标记。图谱覆盖总长度995.73 cM,标记间平均图距为8.82 cM。图谱构建中,RSAP显示了较强多态性检测能力（平均每对引物组合产生约4条多态性带）、操作的简便性和较高的工作效率。4.结合田间性状调查数据,共鉴定出15个辣椒产量相关性状的49个QTL,平均每个性状的QTL数目从16个不等。大多数QTL分布在1、2、8、9和10号辣椒连锁群上,许多相关性较强性状的QTL位于相近位置,提示可能存在基因连锁或一因多效现象。分别检测到株高、果形、果肉厚度、果实数目、早期产量和总产量6个性状效应较高的主效QTL。5.在7条连锁群的不同区段共定位了生长过程中株高的非条件QTL 11个。不同时期检测到的QTL数目和效应存在差别,只有1个QTL在6个时期均能都检测到,表明控制株高的QTL在不同时期的表达是不一样的。根据不同时期的净增长量,共检测到在特定时期控制株高的6个条件QTL,表明辣椒株高的形态建成是不同时期QTL选择性有序表达的结果。因此,在对株高等数量性状进行分子标记辅助选择时,针对不同发育时期的QTL进行选择可能会达到较理想的效果。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1.1 DNA 标记技术及其发展
• 1.1.1 遗传标记的类型及其主要特点
• 1.1.2 DNA 标记技术的类型及其原理
• 1.1.3 DNA 标记技术的新进展
• 1.1.4 分子标记技术的展望
• 1.2 DNA 标记在辣椒遗传育种中的应用
• 1.2.1 辣椒分子遗传图谱的构建
• 1.2.2 辣椒重要农艺性状的QTL 定位
• 1.2.3 辣椒分子标记辅助育种
• 1.2.4 辣椒种质资源鉴定和遗传多样性研究
• 1.3 本研究的目的和意义
• 第二章 一种新型DNA 标记技术—限制性位点扩增多态性（RSAP）的开发与优化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 引物数目的选择
• 2.2.2 PCR 扩增程序与退火温度的确定
• 2.2.3 模板DNA 浓度的确定
• 2+浓度的确定'>2.2.4 最适Mg²⁺浓度的确定
• 2.2.5 RSAP 方法的稳定性检验结果
• 2.2.6 RSAP 方法的适用性
• 2.3 结论与讨论
• 第三章 辣椒优良自交系遗传差异的RSAPS、RAP和SSR比较分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 辣椒优良自交系间分子标记的多态性分析
• 3.2.2 辣椒优良自交系遗传差异的分子检测
• 3.3 讨论
• 3.3.1 对RSAP、SRAP和SSR遗传分析效力的评价
• 3.3.2 基于不同分子标记的辣椒材料间遗传距离的相关性
• 3.3.3 辣椒自交系间遗传差异的分子标记分析
• 第四章 辣椒种内分子连锁图谱的构建
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 RSAP 分析
• 4.2.2 SRAP 分析
• 4.2.3 连锁图谱的构建
• 4.3 讨论
• 4.3.1 作图亲本的选配和群体的建立
• 4.3.2 分子标记方法的选择
• 4.3.3 图谱的饱和及连锁群的染色体定位
• 4.3.4 关于标记的偏分离现象
• 第五章 辣椒产量相关性状QTL定位
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 产量相关性状的表型值及其变异
• 5.2.2 产量相关性状的QTL 定位
• 5.3 讨论
• 5.3.1 辣椒产量相关性状QTL 的数目、分布与来源
• 5.3.2 性状相关与基因连锁或一因多效
• 5.3.3 辣椒产量相关性状的QTL 的效应
• 第六章 辣椒株高的动态QTL分析
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 不同发育时期株高的表型值分析
• 6.2.2 株高发育的动态QTL 分析
• 6.3 讨论
• 6.3.1 不同时期株高QTL 的动态变化
• 6.3.2 动态QTL 分析与数量性状的标记辅助选择
• 第七章 结论
• 7.1 结论
• 7.2 创新点
• 参考文献
• 附录
• 附录1主要试剂的配制
• 附录2 辣椒基因组总DNA 的提取方法
• 附录3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 附录4 辣椒产量相关性状和柱高动态QTL分析的LOD曲线图
• 英文缩写词
• 致谢
• 作者简介