球孢白僵菌对苯并咪唑类杀菌剂抗性的分子机理及遗传改良

论文摘要

丝孢类杀虫真菌是害虫微生物防治的重要资源,球孢白僵菌（Beauveria bassiana）为典型代表。用于作物害虫防治的生防真菌制剂一般都是以分生孢子为有效侵染体的活体制剂,在作物环境中会遇到防治作物病害而喷洒的化学杀菌剂而失活,尤其上世纪六十年代以来被广泛用于防治各种真菌性植物病害的苯并咪唑类杀菌剂。因此,赋于生防真菌抗杀菌剂的特性是提高生防真菌制剂田间适应性和害虫防治效果的重要途径。本研究从20株野生球孢白僵菌分生孢子对多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的抗性评价入手,开展了Bb2860菌株的化学诱变及其若干随机突变子β-微管蛋白编码基因TUB1的序列分析,比较了随机突变子的有丝分裂异常与抗逆性状的关联,进行了TUB1的定点突变分析,分离出抗药性和耐热力的主要关联位点。主要内容分述如下:β-微管蛋突变导致的球孢白僵菌苯并咪唑类杀菌剂抗性及耐热力变化用含不同浓度多菌灵（C）的萨氏培养基（SDAY）平板评价20株野生球孢白僵菌对多菌灵的抗性。将各菌株分生孢子在不同浓度多菌灵的平板上培养4天后的菌落形成数和无药SDAY平板上菌落形成数的比值,定义为分生孢子残存指数Is。各菌株Is观察值分别拟合逻辑斯蒂方程Is=1/[1+exp（α+βC）]（r2≥0.93）。求解拟合的方程得出对各菌株的半致死浓度EC50和最小抑制浓度MIC(即抑菌99%的浓度EC99)。结果显示,20株野生菌除一株为低抗型外,其余对多菌灵均表现敏感。根据各野生株的综合性状,选定Bb2860菌株进行亚硝酸钠处理的化学诱变,获得13个随机突变子,其中2个高抗突变子能拟合上述逻辑斯蒂方程（r2≥0.93）,而其余11个超高抗突变子只能拟合密度方程Is=（α-βC）-1/λ（r2≥0.92）。所有11个超高抗突变子对多菌灵的MIC＞1000μg/mL,在Bb2860野生株的MIC（=1.32μg/mL）提高758倍以上。经三次传代培养,所有随机突变子的抗性均稳定遗传,并且萌发率和产孢能力未受明显影响。所有13个突变子的分生孢子在48℃下随热胁迫时间（t）衰变的残存指数Is也拟合逻辑斯蒂方程Is=1/[1+exp（α+βt）]（r2≥0.97）。结果显示,突变子的半致死时间LT50介于1.8～9.6 min之间,远低于野生株的36 min。对突变子的孢壁类疏水蛋白含量即可甲酸抽提的（FAE）孢壁蛋白含量进行测定后发现,诱变引起的孢子耐热力下降与FAE含量并无关联,而其中EC50＜1000μg/ml的6个突变子加野生菌株的抗药性（0.73～919.6μg/mL）与耐热力之间符合幂函数关系LT50=34.44·(EC50)-0.221（r2=0.96）。TUB1是β-微管蛋白的编码基因,具有高保守性。对13个随机突变子与野生菌株的TUB1进行序列比对后,发现抗药性相关的突变位点Q134、F167和E198也是植物病原真菌中常见的抗药性突变位点。尤其E198位点发生突变的Bb2860突变子的EC50均超过1000μg/ml,而Q134位点的突变发生于12个突变子中,此位点突变在植物病原真菌中可导致热敏感。由于化学诱变的随机性,除上述常见突变位点之外,还发现另外37个位点的突变也出现在各突变子序列中,每个突变子TUB1发生突变的位点有1～8个不等。结果表明,球孢白僵菌与植物病原真菌一样,其β-微管蛋白与苯并咪唑类杀菌剂抗性有密切的关系,特别是E198位点的突变;Q134位点的突变可能与孢子的耐热力下降有关,TUB1其他位点的突变也可能影响球孢白僵菌生理的其他方面。球孢白僵菌β-微管蛋白突变与有丝分裂选择抗药性最强、耐热力最差的突变子Bb2860m2-2为对象,通过有丝分裂的恢复试验和对微管蛋白的荧光免疫染色试验,观察多菌灵和温度对其分生孢子萌发和芽管中有丝分裂的协同影响。用孢子萌发芽管中分裂成双核或多核的孢子数占孢子总数的比值,作为染色体有丝分裂指数CMI。结果发现,30℃下在SDAY平板上生长4天的突变子菌落直径仅为1.1 mm左右,而加入1μg/ml的多菌灵则使菌落直径恢复到3.76 mm,接近于Bb2860野生株在无药SDAY平板上的4.3 mm（25℃）和3.86 mm（30℃）。在不同温度热胁迫试验中,同样发现低浓度多菌灵能降低突变子的热敏感度,特别是在32℃和35℃对其生长的恢复作用明显,40℃以上的恢复作用则不明显。通过荧光免疫染色发现,野生株在存在多菌灵的情况下,微管数量减少,α-及β-微管蛋白的形成也减少,在32℃无药处理中也有此趋势,温度升高与多菌灵的作用类似,均有使微管解聚的现象。在突变株中,在25℃下就出现与野生株不同的情形,芽管中微管蛋白浓度并不连续,大量聚集在芽管顶端,其他部位的分布很不均匀;在32℃下,β-微管蛋白除了聚集在芽管顶端之外,其他部分很少存在,但是α-微管蛋白却弥散于整个芽管和孢子中。另外,在32℃下加入1μg/ml多菌灵,β-微管蛋白的不均匀聚集程度则有所缓和。综合微管免疫染色和CMI的观察结果,微管蛋白基因的突变造成β-微管蛋白对α-微管蛋白竞争结合能力的增强,同时却导致微管的结构异常。微管的不均匀分布在32℃对微管失去聚合动态平衡的温度下,导致游离β-微管蛋白单体出现,而加入多菌灵则可以中和游离的β-微管蛋白,使生长得到恢复。这种过稳定结构温度越高越强,故使多菌灵在更高温度下对突变子的有丝分裂恢复作用不明显。在高温和多菌灵共同解聚作用下,野生菌株的微管蛋白量非常低,而突变子则仍然很高,这显示野生株为避免游离β-微管蛋白单体的毒害而存在蛋白翻译的自我调节机制,突变子则无此功能。β-微管蛋白定点突变对热敏感和抗药性的分离为了明确球孢白僵菌TUB1上位点突变的功能而获得具有多菌灵抗性但无热敏感的工程菌株,选择了2个在随机诱变中表现耐热力和抗药性相关的Q134和E198位点分别进行4种氨基酸的点突变。应用基因重叠延伸技术（SOE）简化基因序列定点突变的改造程序。在进行目的位点的突变之前,把TUB1内部可能发生冲突的酶切位点进行突变,根据球孢白僵菌密码子偏爱和保持突变后氨基酸序列一致的情况下调整TUB1。在定点突变后,利用球孢白僵菌芽生孢子转化体系将经过定点突变的TUB1转入表达载体,再转入白僵菌进行表达和分析。在定点突变的转化子中,Q134K、Q134E、Q134G和Q134C的耐热力明显下降,在48℃热激下的LT50均在5 min之内;多菌灵抗性的增强十分有限,提高最多的Q134G转化子的EC50仅为野生菌株的2倍。E198D、E198G、E198K和E198C的耐热力则显著高于Q134的定点突变转化子,在48℃热激下E198C的LT50为34.3 min,十分接近野生株的36.0 min及pAN52-Bar转化子对照的36.3 min,E198G和E198K的LT50也在30 min左右,耐热力最差的E198D也达23.3 min。E198D对多菌灵的抗性同样优于Q134的定点突变转化子,除E198C抗性增强略低之外,其余突变子均增强10倍左右。根据定点突变转化子的抗逆表现,Q134位点的突变明显与耐热力下降有关,而E198位点的突变则显著提高对多菌灵的抗性。但在多菌灵抗性方面,定点突变未能像随机诱变那样大幅度提高抗药性,这可能与孢子本身TUB1的存在有关。尝试对E198进行其他氨基酸的突变或者对TUB1进行沉默,有可能获得更高的抗性。综上所述,本研究的主要创新,一是建立了球孢白僵菌分生孢子对多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂抗性测定的定量评价技术体系,通过比对TUB1基因的序列发现了多菌灵抗性和β-微管蛋白的相关性。二是通过TUB1基因的定点突变和转化,发现了显著分别影响耐热力和多菌灵抗性的位点Q134和E198,获得了抗药性增强10倍、耐热力不受影响的工程菌株。三是引入CMI概念对微管进行荧光免疫染色,从细胞生物学角度揭示了突变子抗性产生的机理。这些结果都有助于增进对丝孢类生防真菌抗逆生物学基础的认识,有助于推动害虫生防真菌侵染生物学,流行学和剂型生物学的研究不断深入,有助于提升真菌杀虫剂的田间适应性和科技含量。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 丝孢类生防真菌的抗逆生物学研究及应用现状
• 1.1 害虫生防真菌的制剂生物学
• 1.1.1 影响孢子贮存稳定性的因素
• 1.1.2 影响孢子制剂田间稳定性的因素
• 1.1.3 提高菌剂田间稳定性的措施
• 1.2 苯并咪唑类杀菌剂的抗性研究
• 1.2.1 苯并咪唑类杀菌剂对病原菌的作用机制
• 1.2.2 抗药性的利用
• 1.3 微生物基因改造工程
• 1.3.1 化学诱变育种
• 1.3.2 PCR定点诱变
• 1.3.3 真菌的遗传转化
• 1.4 研究目标和意义
• 2 β-微管蛋突变导致的球孢白僵菌苯并咪唑类杀菌剂抗性及耐热力变化
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 野生菌株多菌灵抗性测定
• 2.2.2 抗多菌灵突变菌株的获得
• 2.2.3 白僵菌突变子的多菌灵抗性和耐热力测定
• 2.2.4 突变子RNA的提取
• 2.2.5 部分β-微管蛋白基因扩增
• 2.2.6 RT-PCR序列分析
• 2.2.7 数据模拟分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 野生球孢白僵菌株对多菌灵的敏感性
• 2.3.2 突变菌株对多菌灵的抗性
• 2.3.3 球孢白僵菌突变子的耐热力
• 50、EC₅₀和HLP含量的关系'>2.3.4 LT₅₀、EC₅₀和HLP含量的关系
• 2.3.5 突变子的β-微管蛋白基因突变
• 2.4 讨论
• 3 球孢白僵菌β-微管蛋白突变与有丝分裂
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 有丝分裂中止和恢复
• 3.2.2 突变株萌发率的恢复
• 3.2.3 多菌灵处理分生孢子
• 3.2.4 核染
• 3.2.5 免疫荧光染色
• 3.2.6 染色体有丝分裂指数CMI的测定
• 3.3 结果
• 3.3.1 多菌灵浓度对突变菌株生长的影响
• 3.3.2 热激与多菌灵协同作用对突变株孢子萌发的影响
• 3.3.3 温度和多菌灵协同作用与有丝分裂
• 3.3.4 温度和多菌灵对微管的影响
• 3.4 讨论
• 4 球孢白僵菌β-微管蛋白的定点突变
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 试剂
• 4.2 方法
• 4.2.1 β-微管蛋白编码序列的扩增
• 4.2.2 β-微管蛋白的点突变的预备
• 4.2.3 β-微管蛋白的点突变
• 4.2.4 质粒的构建
• 4.2.5 感受态芽生孢子的制备
• 4.2.6 芽生孢子转化过程
• 4.2.7 转化子鉴定
• 4.2.8 转化子孢子耐热力和多菌灵抗性的测定
• 4.3 结果
• 4.3.1 TUB1的点突变
• 4.3.2 含有点突变TUB1的质粒构建与转化
• 4.3.3 点突变转化子的耐热力和多菌灵抗性比较
• 5 结语
• 参考文献
• Summary
• 附件:攻读学位期间的主要成果