根用芥菜（Brassica juncea var. megarrhiza Tsen et Lee）花药培养与游离小孢子培养技术体系研究

论文摘要

根用芥菜（Brassica juncea var. megarrhiza Tsen et Lee）又名大头菜,是十字花科芸薹属作物、芥菜的一个变种,以其膨大的肉质根为产品器官。我国大头菜育种相对比较落后,生产上的主栽品种为自留种。在常规育种中选育一个纯合的自交系一般需要5-8年,而运用花药培养或游离小孢子培养可以在1-2年获得纯合的双单倍体植株,加快育种进程。本研究以根用芥菜的著名地方品种——狮子头芥菜为试验材料,分别采用花药培养和游离小孢子培养两种不同的培养方法进行试验。试验研究了影响小孢子胚胎发生的几个主要因素,对胚状体的再生和再生植株的驯化移栽也进行了研究,同时还通过多种方式对再生植株进行了倍性鉴定。通过本研究旨在获得完善的大头菜花药培养和游离小孢子培养技术。本试验主要的研究结果如下：1.本试验将花蕾的长度划分为六个等级：2.0mm以下、2.0-2.5mm、2.5-3.0mm、3.0-3.5mm、3.5-4.0mm和4.0mm以上,经显微观察当花蕾长度在2.0-2.5mm时,小孢子处于单核靠边期的比例最高,最适合进行单倍体培养。2.MS、B5和改良的Keller 3种培养基对花药培养出胚率的影响研究表明：MS和B5培养基上没有胚状体的形成,改良的Keller上花药培养的出胚率为0.36个/蕾,改良的Keller培养基更适合进行大头菜花药培养。3.4℃处理0d、1d、3d和5d对花药出胚率的影响研究结果显示,4℃条件下花蕾处理5天与处理3天在对胚状体诱导率上存在显著差异,处理5天的诱导率最低；预冷0d、1d、3d三种处理之间在出胚总数和出胚率上存在差异,但是差异不显著,其中低温处理3d的出胚率最高。4.32.5℃热激处理0d、1d、2d对花药出胚率的影响研究结果显示：32.5℃热激处理1d、2d与不进行热激处理之间,在出胚诱导上存在显著差异,热激处理1d和2d之间没有显著差异,但热激处理两天稍好。5.NLN-13液体培养和NLN-13固液双层培养两种培养方式对游离小孢子培养出胚率的影响研究结果显示,这两种培养方式在出胚率上差异不显著。6.预冷处理中,培养基添加甘露醇对游离小孢子培养出胚率影响研究结果显示：固体B5-13+15g/L甘露醇培养基处理花药的出胚率最高,与液体B5-13添加15g/L甘露醇处理花蕾在游离小孢子培养的出胚率上差异显著,但与液体B5-13添加30g/L和45g/L甘露醇的处理没有显著差异。7.6-BA、KT、2,4-D和NAA 4种激素对游离小孢子培养出胚率的研究结果显示：四个因素中对游离小孢子培养出胚率影响的大小依次为NAA、6-BA、2,4-D、KT,不添加激素的处理为最优组合。8.再生植株气孔保卫细胞叶绿体数目鉴定研究结果显示,正常的二倍体植株叶绿体数目观察值为12～18,单倍体的观察值为3-13,二倍体的观察值为12～20。正常的二倍体植株叶绿体数目较集中,叶绿体数目在14～18个5个变幅之间所占的比例为94.1%,再生植株二倍体中保卫细胞叶绿体数目在14～19个6个变幅之间所占的比例为90.1%,单倍体的保卫细胞叶绿体数目的变异幅度最大,保卫细胞叶绿体数目在4～11个8个变幅之间所占的比例为92.4%。9.再生植株流式细胞仪倍性鉴定结果显示,本试验所获得的材料只有单倍体和二倍体,自然加倍率为50%,检测没有发现多倍体和嵌合体。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 课题的提出
• 1.1.1 大头菜的发展潜力
• 1.1.2 大头菜的育种现状
• 1.2 课题研究的目的、意义
• 1.2.1 花药培养与游离小孢子培养研究的意义
• 2 研究进展
• 2.1 花药培养和游离小孢子培养
• 2.1.1 影响胚诱导率的因素
• 2.1.1.1 供体的基因型
• 2.1.1.2 供体小孢子所处发育时期
• 2.1.2 供体材料的预处理
• 2.1.2.1 低温预处理
• 2.1.3 基本培养基及添加物
• 2.1.3.1 基本培养基
• 2.1.3.2 培养基中的碳源及浓度
• 2.1.3.3 外源有机物
• 2.1.3.4 活性炭
• 2.1.3.5 培养基中激素的种类与含量
• 2.1.3.6 秋水仙素等
• 2.1.3.7 培养基的pH值
• 2.1.4 小孢子的培养密度
• 2.1.5 培养方式
• 2.2 影响小孢子胚的再生的因素
• 2.2.1 小孢子胚的类型
• 2.2.2 小孢子胚在液体培养基中的滞留时间
• 2.2.3 再生培养基的琼脂含量
• 2.3 小孢子再生植株的倍性鉴定
• 2.3.1 染色体鉴定
• 2.3.2 形态学鉴定
• 2.3.3.2 保卫细胞的叶绿体数量鉴定
• 2.3.4 流式细胞仪鉴定
• 3 材料与方法
• 3.1 试验材料
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 小孢子发育时期观察时染色液的选择
• 3.2.2 花蕾发育时期的观测
• 3.2.3 花序处理及保存
• 3.2.4 花药培养
• 3.2.4.1 花药培养所使用的培养基
• 3.2.4.2 花药培养的基础操作过程
• 3.2.4.3 花药培养试验
• 3.2.5. 游离小孢子培养
• 3.2.5.1 游离小孢子培养所使用到的培养基
• 3.2.5.2 游离小孢子培养基础操作过程
• 3.2.5.3 游离小孢子培养试验
• 3.2.6 胚状体的再生培养
• 3.2.7 再生植株的移栽
• 3.2.8 再生植株的倍性鉴定
• 3.2.8.1 根尖染色体计数法
• 3.2.8.2 形态学鉴定法
• 3.2.8.3 气孔保卫细胞叶绿体计数法检测倍性
• 3.2.8.4 流式细胞仪（FCM）检测再生植株的倍性
• 3.2.9 再生植株的加倍
• 3.3 统计分析
• 4 结果与分析
• 4.1 花蕾发育时期的观察与选择
• 4.1.1 小孢子不同时期的发育形态
• 4.1.2 花蕾长度与小孢子的发育时期
• 4.2 花药培养
• 4.2.1 培养基对出胚率的影响
• 4.2.2 激素对出胚率的影响
• 4.2.3 预冷天数对出胚率的影响
• 4.2.4 热激天数对出胚率的影响
• 4.3 游离小孢子培养
• 4.3.1 培养方式对出胚率的影响
• 4.3.2 预处理方式对出胚率的影响
• 4.3.3 添加激素对出胚的影响
• 4.4 胚状体的再生培养
• 4.5 再生植株的移栽驯化
• 4.6 污染植株的挽救
• 4.7 再生植株的倍性鉴定
• 4.7.1 根尖染色体倍性鉴定
• 4.7.2 再生植株的性状观察
• 4.7.3 气孔保卫细胞叶绿体数目鉴定再生植株倍性
• 4.7.4 流式细胞仪鉴定再生植株倍性
• 5 讨论
• 5.1 花蕾和小孢子发育时期的选择
• 5.2 花蕾的保存
• 5.3 花药培养
• 5.3.1 基本培养基对出胚的影响
• 5.3.2 培养基中添加激素对出胚的影响
• 5.3.3 预冷处理和热激处理对出胚的影响
• 5.4 游离小孢子培养
• 5.4.1 培养方式对出胚的影响
• 5.4.2 甘露醇预处理对出胚的影响
• 5.4.3 激素对小孢子培养的影响
• 5.5 综合比较各因素对小孢子胚胎发生的影响
• 5.6 胚状体的再生培养
• 5.7 促进胚状体发育成熟的尝试
• 5.8 再生植株的驯化移栽
• 5.9 再生植株的倍性鉴定
• 5.10 再生植株的继代
• 展望
• 参考文献
• 附录
• 图版
• 致谢