论文摘要
严重创伤、感染,失血性、内毒素等各型休克晚期均存在血管低反应性,即血管对各种血管活性物质的反应性减弱甚至不反应。这种血管的低反应性严重影响着休克的发展及治疗,是影响休克患者死亡率的重要原因。目前认为休克后的血管低反应性发生主要是由于肾上腺素能、内皮素受体等失敏（表达下降和或亲和力下降）;钾、钙通道的过度激活引起血管平滑肌细胞膜的超极化,以及血管平滑肌细胞钙失敏所致。内毒素休克的主要特征是机体的过度炎症反应,大量细胞因子如TNF-α、IL-1β、ΙL?6等释放,在内毒素休克的病理生理过程中起重要作用。体内、外研究均显示IL-1β能够介导血管收缩反应性下降,目前认为它主要通过ΝΟ依赖性和ΝΟ非依赖性机制来介导的,前者认为IL-1β是通过使iNOS活性升高而使ΝΟ产量增多而发挥作用的;后者认为IL-1β是通过使血管受体如抗利尿激素受体、内皮素受体等表达量下降和或亲和力下降及激活KATP通道、BKCa通道引起血管平滑肌细胞膜超极化来实现的。但是针对上述机制纠正这些不利因素,尚不能完全恢复血管反应性,更不能完全缓解内毒素休克的病理生理进程,提示还存在着其它机制。与出血性休克一致,本实验室前期研究发现内毒素休克后期同样存在钙失敏,且钙失敏在休克后血管低反应发生中起重要作用。研究发现内毒素休克后IL-1β可使血管平滑肌细胞α1肾上腺素受体基因表达下调,IL-1β是否通过α1肾上腺素能受体失敏和钙失敏来介导休克后的血管低反应性发生呢?目前尚不清楚。为此,本实验利用家兔内毒素休克模型和离体血管环对此进行了较为系统的研究。主要实验方法:第一部分:明确IL-1β是否通过调节家兔血管α1肾上腺素能受体敏感性和钙敏感性来介导内毒素休克后血管反应性的变化1.采用LPS静注复制家兔内毒素休克模型,测定不同时相点（正常,给LPS后30 min、1h、2h、4h）肠系膜上动脉血管反应性,钙敏感性,α1AR mRNA表达及血清IL-1β的水平,观察其变化规律,分析它们之间的相关性。2.在无菌无RNA酶的实验条件下,取正常家兔内皮完整的SMA,将其与不同浓度（25、50、100、150、200 ng/ml）IL-1β孵育12h,观察其血管反应性和钙敏感性以及α1(包括α1A、α1B、α1D三个亚型)肾上腺素能受体（α1AR）的mRNA水平的变化（用RT-PCR法）。3.应用4μg/kg IL-1ra（IL-1受体拮抗剂,peprotech）在家兔给LPS后30 min静脉注射,观察给LPS后4h家兔SMA的血管反应性和钙敏感性以及α1AR mRNA水平的变化。第二部分:初步探索IL-1β调节血管钙敏感性的机制1.应用PKC、Rho激酶特异的激动剂和拮抗剂,分别为:PKC (10-5mol/L PMA和10-5mol/L staurosporine)及Rho kinase (10-9mol/L Ang-Ⅱ和10-5mol/L Y27632),在加入梯度浓度Ca2+前孵育血管环15min,观察其对经200ng/ml IL-1β孵育SMA的钙敏感性的影响。2.应用非放射性酶活性测定试剂盒（Promega和Cyclex MBL）,测定与不同浓度（0,50,100ng/ml）IL-1β孵育的SMA的PKC、Rho激酶活性变化。3.应用Western blot方法,测定与不同浓度（0,50,100ng/ml）IL-1β孵育的SMA MLC20磷酸化水平的变化。第三部分:初步探索IL-1β介导α1肾上腺素能受体失敏的机制1.应用10μmol/L磷脂酶C（PLC）特异性抑制剂u73122,并设立空白对照组（不加任何试剂）和u73343组（加入u73122的结构类似物u73343,但无其类似功能）,观察其对经不同浓度IL-1β孵育的SMAα1AR对PE反应性的影响。2.应用PC-PLC活性测定试剂盒（invitrogen） ,测定经不同浓度（0 , 50 ,100ng/ml）IL-1β孵育的SMA的PLC活性变化。3.应用50μmol/L JAK-STAT3途径抑制剂AG490,将其与IL-1β共同孵育SMA,观察其对50ng/ml IL-1β孵育的SMAα1AR mRNA表达的影响。主要研究结果:一.IL-1β通过调节α1肾上腺素能受体敏感性和钙敏感性介导内毒素休克后血管低反应性的发生1.家兔内毒素休克后SMA存在钙失敏和α1AR失敏,表现为LPS静注后,早期（即给LPS后30min1h）SMA血管环对PE和钙的反应性升高,量-效曲线左移,Emax升高（p<0.05或p<0.01）,pD2值无明显变化（p>0.05）;随着时间的延长,SMA血管环对PE和钙的反应性迅速下降,到晚期（给LPS 2h和4h后）明显降低,其量-效曲线明显右移, Emax明显降低（p<0.01）,pD2值明显降低（p<0.01）。家兔给LPS后30min起,α1AR（主要是α1B和α1DAR）mRNA表达水平即开始明显下降（p<0.05）,并呈时间依赖性降低。家兔内毒素休克后血清IL-1β在给LPS后2h开始升高,到4h时升高明显（p<0.01）,血清IL-1β水平与内毒素休克晚期血管反应性和钙敏感性及α1AR mRNA表达水平的变化存在显著负相关（p<0.01）,血管反应性和钙敏感性变化存在显著正相关（p<0.01）。2.与空白对照组（不含IL-1β孵育）相比,经与不同浓度（25ng/ml-200ng/ml）IL?1β孵育的SMA对PE的反应性均有降低（p<0.05或p<0.01） ;在与25ng/ml、50ng/ml IL-1β孵育12h后血管环对钙敏感性的量效曲线即开始右移,Emax开始下降,但无统计学差异,在100ng/ml时Emax明显下降（p<0.05）,在150ng/ml和200ng/ml时下降更明显（p<0.01）;α1AR(包括α1A、α1B、α1D三个亚型)mRNA从25ng/ml开始即有明显下降（p<0.05）,呈浓度依赖性降低。3.IL-1ra能明显提高给LPS后4h组SMA血管环的钙敏感性和α1AR的反应性（p<0.05）,Emax值明显升高（p<0.05）,但pD2值无明显改变（p>0.05）。IL-1ra能明显提高α1AR（主要是B、D两个亚型）mRNA表达水平（p<0.05）。二.IL-1β调节血管钙敏感性的初步机制1. PKC、Rho激酶的激动剂能明显提高200 ng/ml IL-1β孵育组的血管钙敏感性,表现为量-效曲线左移,Emax增大（p<0.05）,Rho激酶特异的抑制剂能明显降低其钙敏感性,表现为量?效曲线右移,Emax减小（p<0.05）,但PKC特异的抑制剂却不能明显改变其钙敏感性（p>0.05）。2.与空白对照组相比,PKC、Rho激酶的活性在50 ng/ml IL-1β孵育组已经开始下降,但无统计学差异（p>0.05）,而在100 ng/ml IL-1β孵育组明显下降（p<0.05）。3.与空白对照组相比,MLC20磷酸化水平在50 ng/ml IL-1β孵育组已经开始下降,100 ng/ml IL-1β孵育组SMA中明显下降,表现为MLC20磷酸化/非磷酸化灰度比值明显下降（p<0.05）。三.IL-1β介导α1肾上腺素能受体失敏的初步机制1.与u73343组及空白对照组相比,u73122不能改变IL-1β孵育组SMA血管环α1AR对PE的反应性,量效曲线、Emax值及pD2值均无明显变化（p>0.05）。2.与空白对照组相比,50 ng/ml及100 ng/ml IL-1β孵育组SMA中PLC活性无明显变化,表现为各组的荧光强度值无明显差异（p>0.05）。3.与100ng/ml IL-1β孵育组及100ng/ml IL-1β+DMSO孵育组相比,AG490能明显升高100 ng/ml IL-1β孵育组α1AR（主要是α1B、α1D两个亚型）mRNA表达水平,提示JAK-STAT3通路可能参与了IL-1β调节α1AR的表达。结论:1. IL-1β可能通过调节α1肾上腺素能受体和钙敏感性参与内毒素休克后血管低反应性的发生2. IL-1β可能通过改变PKC、Rho激酶的活性及MLC20的磷酸化水平介导内毒素休克血管钙敏感性降低。3. IL-1β可能通过JAK-STAT3途径调节α1肾上腺素能受体的表达介导α1肾上腺素能受体失敏。