论文摘要
[目的]微小RNA（microRNA,miRNA）是一类长约22个核苷酸的非编码单链小分子RNA,大多由RNA聚合酶Ⅱ转录生成,可通过引发靶mRNA的降解或翻译抑制来介导转录后基因沉默从而参与多种生理和病理过程。虽然miRNA在许多发育和生理病理过程中起着重要的作用,但其表达调控的机制我们还不是很清楚。miR-371、-372、-373作为一个基因簇是同时转录的,本课题应用多种实验方法对miR-371-373的表达的调控机制进行研究。进一步阐明miR-371-373可能的作用机制,从而为肿瘤发生发展的研究提供新的分子基础和治疗靶位提供实验依据。[方法]首先利用生物信息学原理预测miR-371-373的启动子、转录因子结合位点（TFBS）、miRNA结合位点以及CpG岛。根据预测启动子的位置,在其上游设计多个长短各异的启动子片段,分别克隆到pGL3-basic/EGFP载体中并在人三种肝癌细胞系（HepG2、LM6、QGY-7703）和肝正常细胞系中（L-02）进行验证。随后通过5’ RACE确定转录起始位点。最后依据预测的调控因子及CpG岛结果进一步通过报告载体实验及Real-time PCR等方法初步验证其上游调控原件。[结果]我们成功构建了 miR-371-373 cluster的启动子,发现在四种细胞系中,p1000,p860和p148有启动子活性,且p1000启动子活性最强。5’ RACE验证了 miR-371-373启动子的转录起始位点在上游591bp处。随后我们通过生物信息学原理预测Sp1和GATA1可靶定miR-371的5’ UTR区。过表达Sp1和GATA1可促进miR-371、miR-372和miR-373的表达,最后通过软件预测miR-371上游有一个CpG岛,经5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）处理结果表明,去甲基化后可增加miR-371-373的表达。[结论]在肝癌细胞系中克隆并确定了 miR-371-373的启动子序列且鉴定了转录起始位点。转录因子Sp1和GATA1能够靶定miR-371-373 cluster的启动子,并影响这个基因簇的表达。在人肝癌细胞系中阐明miR-371-373的转录调控作用机制有利于我们对恶性肿瘤的发生和发展进行深入的了解,同时也为肿瘤诊断和治疗研究提供新的线索。