农杆菌介导的枳和早实枳遗传转化及转基因植株抗性鉴定

论文摘要

柑橘是我国第一大水果,干旱是影响其生长和发育的最主要环境因子之一,因此柑橘的抗旱性的研究十分重要。遗传转化是获得抗逆种质的途径之一。本研究以不抗旱的砧木枳及童期较短的早实枳作为转化材料,通过根癌农杆菌介导法转入本实验室克隆的PtrABF2和PtrCDPK1基因。取得的主要研究结果如下：1、转化和再生：通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法,PtrABF2基因累计转化早实枳上胚轴1200个,枳上胚轴640个,分别获得再生芽体120、10个；PtrCDPK1基因累计转化早实枳上胚轴1500个,枳上胚轴800个,分别获得再生芽体90、46个。对芽体进行继代并进行分子鉴定。2、再生植株分子鉴定：对再生抗性苗进行PCR检测,共得到早实枳转ABF阳性苗15株,早实枳转PtrCDPK1阳性苗32株,枳转PtrCDPK1阳性苗16株,采用实时定量PCR对部分阳性苗进行外源基因表达分析,结果表明转基因植株中,与野生型对照相比,外源基因表达量均有不同程度的升高。3.PtrABF2转基因植株脱水抗性分析：对2个早实枳PtrABF2转基因株系和野生型叶片进行脱水处理,结果表明,脱水处理90min后野生型对照的的叶片萎蔫更严重,且相对失水率和脱水后电导率测定结果明显高于转基因植株。该结果初步证明PtrABF2转基因植株抗脱水能力增强。4、ROS含量和细胞死亡分析：对脱水后的PtrABF2转基因株系及野生型叶片进行台盼蓝、DAB和NBT染色,结果表明脱水后转基因植株细胞死亡和ROS含量低于野生型,表明维持低ROS水平可能是转基因植株抗性提高的一个原因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 课题提出
• 1.2 柑橘的遗传转化研究进展
• 1.2.1 柑橘遗传转化方法
• 1.2.2 柑橘遗传转化基因类型
• 1.2.3 柑橘遗传转化的影响因素
• 1.3 柑橘抗旱研究进展
• 1.3.1 植物形态结构上对干旱胁迫的适应
• 1.3.2 植物生理生化上对干旱胁迫的适应
• 1.3.3 植物分子水平上对干旱胁迫的适应
• 1.4 本实验的目的及意义
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物受体材料
• 2.1.2 载体和农杆菌菌株
• 2.1.3 培养基配方
• 2.1.4 主要试剂与仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 根癌农杆菌侵染液的准备
• 2.2.2 根癌农杆菌介导的枳类遗传转化
• 2.2.3 质粒DNA的提取
• 2.2.4 柑橘基因组DNA的提取
• 2.2.5 PCR检测
• 2.2.6 柑橘总RNA的提取
• 2.2.7 转基因柑橘real-time PCR分析
• 2.2.8 相对失水率的测定
• 2.2.9 相对电导率的测定
• 2.2.10 台盼蓝（trypan blue）染色
• 2.2.11 氯化硝基四氮唑兰（NBT）染色
• 2.2.12 二氨基联苯胺（DAB）染色
• 3 结果分析
• 3.1 枳与早实枳的转化与再生
• 3.2 转基因植株的PCR鉴定
• 3.2.1 PtrABF转早实枳的PCR鉴定
• 3.2.2 PtrABF转枳的PCR鉴定
• 3.2.3 PtCDPK转早实枳的PCR鉴定
• 3.2.4 PtCDPK转枳的PCR鉴定
• 3.3 转基因植株Real time-PCR分析
• 3.4 PtrABF转早实枳干旱脱水处理
• 3.5 PtrABF转早实枳的相对失水率的测定
• 3.6 PtrABF转早实枳的电导率的测定
• 3.7 PtrABF转早实枳脱水处理后细胞活性检测
• 3.8 PtrABF转早实枳脱水处理后ROS积累检测
• 4 讨论
• 参考文献
• 图版及说明
• 致谢