论文摘要
股骨头缺血性坏死是由各种原因引起的股骨头血液循环障碍性疾病,是骨科疑难病之一。近年来,由于外伤、大量饮酒、高凝血状态、长期服用皮质类固醇激素药物等,该病发病率日渐增高。严重地影响着人们的健康及运动,已引起国内外骨科学者重视,成为临床亟待解决的重要课题。股骨头坏死早期病程可以逆转,演变的周期很长,进展至退行性髋关节病变晚期需3～5年。如早期不能得到及时有效的治疗,就会使股骨头塌陷,关节间隙变窄,最后导致坏死性骨关节炎,使病人髋关节功能障碍而致残。股骨头坏死的治疗方法很多,但迄今尚未有一种方法能保存股骨头的活力。对于已经塌陷的股骨头更是缺乏有效的治疗方法,晚期患者只能通过全髋关节置换来治疗,给患者及家属身心带来了很大痛苦,经济上也产生沉重的负担。因此,把研究的焦点集中在早期股骨头坏死的治疗上,寻找安全、高效、经济的治疗方法,有着重要的临床意义和社会效益。本实验首先联合应用内毒素和甲基强的松龙诱导兔早期股骨头坏死动物模型,应用不同能量强度与剂量参数的高能震波进行治疗,观测其对股骨头组织结构,血管、骨结构重建的影响,分析其治疗股骨头坏死的能量方式、强度与剂量的最佳参数;同时应用免疫组化和细胞、分子生物学技术,观测高能震波对股骨头骨形态发生蛋白2（BMP-2）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）及其基因表达的影响,探讨其作用机理,为临床推广应用提供理论依据。首先,诱导早期股骨头缺血性坏死的动物模型。联合应用内毒素和甲基强的松龙诱导兔早期股骨头坏死,健康成年雄性新西兰白兔耳缘静脉内注射大肠杆菌内毒素10μg /kg ,24h后重复给药一次,在第二次注射大肠杆菌内毒素后,立即臀肌注射甲基强的松龙40mg/kg,共三次,每次间隔24h。将动物在最后一次注射药物后6周静脉注射气栓处死,取股骨头标本做组织学检查。通过X线照相、CT、MRI和骨组织形态学检查、超微结构检查鉴定股骨头坏死模型成功建立。本方法能诱导出典型的兔早期股骨头缺血性坏死模型,成功率高,重复性好。其次,应用高能震波治疗兔股骨头缺血性坏死,观察高能震波对股骨头微血管、骨结构的重建及组织细胞的影响。成功建立股骨头坏死模型后,采用以色列MEDISPEC公司生产的Orthospec（TM）骨伤科震波治疗仪进行治疗实验。治疗前用脱毛剂（硫酸钡）将兔双髋皮肤绒毛脱净,涂上医用超声耦合剂,2.5%的戊巴比妥静脉麻醉,绑扎固定于自制兔台上,将高能震波的焦点对准股骨头。所有实验兔左后腿作为治疗侧,用能流密度0.26mJ/mm2,频率1Hz,冲击量为2000次的高能震波治疗,右后腿作为对照侧,不予治疗。应用X线照相、CT、MRI和骨组织形态学检查、超微结构检查;观察股骨头微血管、骨结构的重建及组织细胞治疗前后改变。治疗后4周,X线照相、CT、MRI示双侧股骨头与治疗前无明显差异。治疗后12周,X线检查显示治疗侧股骨头点状、线状密度减低影明显减少或消失,对照侧则无明显变化;CT示治疗侧股骨头密度增加,囊状透亮区减小或消失,对照侧股骨头密度也轻微增加,但囊状透亮区仍存在;MRI示治疗侧股骨头异常信号条带减少或消失,对照侧股骨头T1WI和T2WI上低信号条带仍明显存在,与治疗前无明显差异。股骨头墨汁血管灌注检查发现治疗后4周治疗侧股骨头微血管较对照侧多,微血管密度高于对照侧。治疗后12周治疗侧股骨头血管明显增多、增粗,分布均匀;对照侧股骨头微血管虽较前增加,但明显少于治疗侧。骨组织形态学检查显示治疗侧股骨头与对照侧相比静态参数骨小梁面积百分数（Tb.Ar %）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）和小梁连结点数（N.Nd）和游离末端数（N.Tm）之比（NTR）均明显增加,显著高于对照侧,骨小梁间距（Tb.Sp）明显减小,显著低于对照侧;动态骨形成参数荧光标记周长百分率（%L.Pm ）、二次荧光标记间距（ IrL. W i ）和骨形成率（BFR/BV）也显著增加。治疗侧股骨头四环素染色强,双标记线多,双标记线间距宽,骨小梁较宽,排列紧密,类骨质丰富;而对照侧股骨头荧光染色浅,双标记线少,双标记线间距窄,骨小梁细而排列稀疏,类骨质少见。透射电镜观察可见高能震波治疗后成骨细胞的数量增加,细胞体积大,呈圆形或椭圆形,线粒体丰富,胞浆内有大量粗面内质网,成骨细胞的这些形态特点说明成骨细胞的功能活跃。结果证实高能震波治疗能够有效促进成骨细胞的分化、增殖,改善成骨细胞的功能状态,同时增加股骨头微血管的生成,促进股骨头骨的生成和骨结构的重建。再次,应用高能震波治疗兔股骨头缺血性坏死,观察高能震波对股骨头骨形态发生蛋白2（BMP-2）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）及其基因表达的影响。成功建立股骨头坏死模型后,采用以色列MEDISPEC公司生产的Orthospec（TM）骨伤科震波治疗仪进行治疗实验。治疗前用脱毛剂（硫酸钡）将兔双髋皮肤绒毛脱净,涂上医用超声耦合剂,2.5%的戊巴比妥静脉麻醉,绑扎固定于自制兔台上,将高能震波的焦点对准股骨头。所有实验兔左后腿作为治疗侧,用能流密度0.26mJ/mm2,频率1Hz,冲击量为2000次的高能震波治疗,右后腿作为对照侧,不予治疗。治疗后24小时和第1,2,4,8,12周各取6只动物处死,取股骨头标本行实时荧光定量PCR、免疫组化和Western-blot分析,检测BMP-2和VEGF的mRNA和蛋白表达水平,评估高能震波对股骨头BMP-2和VEGF及其基因表达的影响。免疫组化显示对照侧股骨头软骨下骨组织中成骨细胞和血管内皮细胞有少量VEGF的阳性表达,成骨细胞和成纤维细胞有少量BMP-2的阳性表达。高能震波治疗后2-4周,成骨细胞和血管内皮细胞VEGF的表达增强,成骨细胞和成纤维细胞BMP-2的表达增强。治疗后8周,纤维肉芽组织中的成纤维细胞和血管内皮细胞有VEGF的强阳性表达,骨基质和骨细胞也有VEGF的阳性表达;成纤维细胞BMP-2的表达呈强阳性染色,骨基质中也有BMP-2的阳性表达。治疗后12周,骨小梁和骨髓中均有VEGF和BMP-2的表达,沿骨小梁排列的成骨细胞VEGF和BMP-2的表达呈强阳性。治疗后4-12周,治疗侧股骨头VEGF和BMP-2的平均染色面积百分比和平均吸光度均显著高于对照侧。实时荧光定量PCR证实高能震波治疗显著增加了兔股骨头骨组织中VEGF和BMP-2 mRNA的表达,治疗侧股骨头VEGF mRNA的表达在治疗后第1,2,4和8周显著高于对照侧,在治疗后第2周VEGF mRNA的表达最高;治疗侧股骨头BMP-2 mRNA的表达在治疗后第24小时以及第1,2,4,8周显著高于对照侧,在治疗后第1周BMP-2mRNA的表达最高。Western-blot分析发现高能震波治疗显著增加了兔股骨头骨组织中VEGF和BMP-2蛋白的表达,治疗侧股骨头VEGF蛋白的表达在治疗后第2,4 ,8和12周显著高于对照侧,在治疗后第4周VEGF蛋白的表达最高;治疗侧股骨头BMP-2蛋白的表达在治疗后第1,2,4,8周显著高于对照侧,在治疗后第2周BMP-2蛋白的表达最高。结果证实高能震波治疗能够显著增加兔股骨头BMP-2和VEGF及其基因的表达,这些细胞因子表达的增加对促进股骨头的血管生成和骨修复具有重要作用,在分子水平上证实高能震波治疗股骨头坏死是有效的,为高能震波治疗股骨头坏死提供了坚实的理论基础。最后,应用不同能量强度和剂量高能震波治疗股骨头坏死,确立高能震波治疗股骨头坏死的最佳能量强度和剂量参数。成功建立股骨头坏死模型后,采用以色列MEDISPEC公司生产的Orthospec（TM）骨伤科震波治疗仪进行治疗实验。治疗前用脱毛剂（硫酸钡）将兔双髋皮肤绒毛脱净,2.5%戊巴比妥麻醉,绑扎固定于自制兔台上,将高能震波的焦点对准股骨头。所有实验兔左后腿作为治疗侧。将股骨头坏死动物模型随机分为七组（A、B、C、D、E、F和G）,其中A、B、C、D组分别用能量流密度为0.16mJ/mm2、0.21mJ/mm2、0.26mJ/mm2和0.32mJ/mm2的冲击波治疗,冲击次数均为2000次;E和F组均用能量流密度为0.26mJ/mm2的冲击波治疗,冲击次数分别为1000次和4000次,G组为对照组,不予治疗。治疗后通过股骨头墨汁血管灌注检查、骨组织形态学检查和超微结构检查,观察股骨头微血管、骨结构的重建及组织细胞治疗前后改变。股骨头墨汁血管灌注检查发现治疗后12周,B、C、D、和F组股骨头血管明显增多、增粗,分布均匀;A和E组股骨头微血管纤细,无明显增加。骨组织形态学检查显示治疗后12周,B、C、D、和F组股骨头骨小梁增粗,骨小梁面积百分比显著高于G组,A和E组股骨头骨小梁稀疏,骨小梁面积百分比无明显增加。超微结构观察显示,高能震波治疗后B、C、D、和F组股骨头成骨细胞呈圆形或椭圆形,细胞体积大,胞浆内有大量粗面内质网,形成附有核糖体的膜状管,线粒体数量多,核染色淡,结构完整。内皮细胞核染色浅,胞质丰富,含有大量细胞器。结果证实应用高能震波治疗兔早期股骨头坏死,当冲击次数大于2000次,能量流密度为0.21mJ/mm2至0.32mJ/mm2时能够有效促进坏死股骨头的血管生成和骨修复。
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