微胶囊固定化重组大肠杆菌萃取发酵生产L-苯丙氨酸的研究

论文摘要

作为人体八种必需氨基酸之一的L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine, L-Phe）,是一种重要的合成中间体,在食品和医药领域有广泛的应用,可作为食品添加剂、抗癌药物中间体和合成阿斯巴甜的原料,具有非常广阔的市场前景。利用固定化重组大肠杆菌细胞发酵生产L-Phe,是当前制备L-Phe应用最广泛的一种方法。本文利用两种新型微胶囊——SA-CMC/CaCl2微胶囊体系与NaCS-PDMDAAC微胶囊体系对重组大肠杆菌进行固定化,探索了它们在萃取发酵生产L-Phe过程中的特性,并与游离细胞培养作了比较,试图对实验室探索L-Phe的工艺以及大规模生产L-Phe提供理论依据。论文先对有机溶液萃取分离L-Phe作了比较系统的研究:以磷酸二（2-乙基己基）脂（D2EHPA）为萃取剂,环己烷为稀释剂萃取L-Phe,研究了L-Phe浓度、D2EHPA浓度、温度对萃取分配系数D的影响,以及负载L-Phe有机相的反萃取特性。结果表明:萃取分配系数D随温度的升高而降低,而L-Phe浓度对分配系数的影响还与水相初始pH值有关;萃合物是以一个L-Phe分子和二个D2EHPA分子结合而成。在利用酸溶液对负载L-Phe有机相的反萃取过程中,反萃取的效果符合HCl > HNO3≥H2SO4 > CH3COOH,且随HCl浓度和温度的升高而升高。然后研究了游离重组大肠杆菌细胞生长特性,结果表明:在游离培养的情况下,培养12 h时即可达稳定期,葡萄糖也在这一时间段内被迅速消耗,到14 h时葡萄糖已消耗完全,而L-Phe的产量在对数期（10 h左右）达到峰值,但此后出现一定的下降,这可能是在游离培养达稳定期时被细胞消耗所致。萃取剂对重组大肠杆菌具有毒害作用,所以在后续的研究过程中,必须避免使菌体细胞直接与萃取剂进行接触。而两种新型固定化体系——SA-CMC/CaCl2微胶囊体系和NaCS-PDMDAAC微胶囊体系具有良好的生物相容性,可用于重组大肠杆菌的发酵生产过程。接下来研究了SA-CMC/CaCl2微胶囊固定化重组大肠杆菌萃取发酵生产L-Phe,先是确定了有利发酵过程的微胶囊制备浓度:12～14 g L-1的CMC,8～10 g L-1的SA,12～14 g L-1的CMC,80～100 g L-1的CaCl2。然后考察了不同制备浓度制备的微胶囊的机械性能,结果表明SA-CMC/CaCl2微胶囊在萃取剂存在的情况下稳定性非常差,其中以12.0 g L-1 CMC、10.0 g L-1 SA、100.0 g L-1CaCl2制备得到微胶囊的稳定性相对较好。最后考察以12.0 g L-1 CMC、10.0 g L-1 SA、100.0 g L-1CaCl2制备得到的微胶囊固定化重组大肠杆菌萃取发酵生产L-Phe的情况,结果表明:由于受传质的影响,SA-CMC/CaCl2微胶囊固定化培养的延迟期延长了2 h左右,但最终的菌体浓度略为升高;另外在生长末期,微胶囊固定化情况下的L-Phe没有明显的消耗;同时,在0 h时加入萃取剂的微胶囊固定化萃取发酵过程的产量约为1.70 g L-1 L-Phe;14 h的产量约为10.40 g L-1 L-Phe。最后考察了NaCS-PDMDAAC微胶囊固定化重组大肠杆菌萃取发酵生产L-Phe,先确定了有利发酵过程的微胶囊制备浓度:3%～4%的NaCS,4%～5%的PDMDAAC。然后考察了不同制备浓度下制备的微胶囊的机械性能,结果表明NaCS-PDMDAAC微胶囊具备非常良好稳定性,并不受萃取剂的影响。综合考虑传质因素,认为以3%的NaCS,4%的PDMDAAC制备得到微胶囊用于固定化重组大肠杆菌培养更好。研究以3%的NaCS,4%的PDMDAAC制备得到的微胶囊固定化重组大肠杆菌萃取发酵生产L-Phe,结果表明:由于NaCS-PDMDAAC微胶囊囊膜非常致密,受传质影响,NaCS-PDMDAAC微胶囊固定化培养的延迟期比游离培养延长了4 h左右,比SA-CMC/CaCl2微胶囊固定化培养延长了2 h左右,而且最终的菌体浓度相对偏低、葡萄糖并未完全消耗,最终的残糖浓度约为4 g L-1左右;另外,在生长末期,L-Phe不存在消耗过程;同时,在0 h时加入萃取剂的微胶囊固定化萃取发酵产量约为12.50 g L-1 L-Phe;22 h的产量约为13.16 g L-1L-Phe。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 引言
• 1.1 L-Phe 概况
• 1.1.1 L-Phe 的理化性质
• 1.1.2 L-Phe 的应用及国内外市场概况
• 1.1.3 L-Phe 的生产方法
• 1.1.3.1 提取法
• 1.1.3.2 化学合成法
• 1.1.3.3 发酵法
• 1.1.3.4 酶法
• 1.2 细胞固定化技术
• 1.2.1 吸附法
• 1.2.2 离子/共价交联
• 1.2.3 包埋法
• 1.2.4 生物微胶囊技术
• 1.2.4.1 生物微胶囊的制备方法
• 1.2.4.2 生物微胶囊的性能
• 1.2.4.3 常用的生物微胶囊体系
• 2 微胶囊体系'>1.2.5 SA-CMC/CaCl₂微胶囊体系
• 2 微胶囊的制备机理'>1.2.5.1 SA-CMC/CaCl₂微胶囊的制备机理
• 2 微胶囊的应用'>1.2.5.2 SA-CMC/CaCl₂微胶囊的应用
• 1.2.6 NaCS-PDMDAAC 微胶囊体系
• 1.2.6.1 NaCS-PDMDAAC 微胶囊制备方法
• 1.2.6.2 NaCS-PDMDAAC 微胶囊的应用
• 1.3 L-Phe 的萃取分离
• 1.4 本课题的研究意义及研究内容
• 1.4.1 研究意义
• 1.4.2 研究内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种及其保藏
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 其它主要试剂及仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 培养方法
• 2.2.2 菌体生长量测定
• 2.2.3 葡萄糖浓度的测定
• 2.2.4 L-Phe 测定
• 2.2.5 NaCS 的制备
• 2.2.6 微胶囊的制备
• 2.2.7 微胶囊的机械性能
• 第三章 有机溶剂萃取分离 L-Phe
• 引言
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验试剂
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.3 分析方法
• 3.2 实验结果与讨论
• 3.2.1 稀释剂对实验的影响
• 3.2.2 萃取前后水相溶液pH 值的变化
• 3.2.3 L-Phe 浓度对分配系数的影响
• 3.2.4 D2EHPA 浓度对分配系数的影响及萃合物的结构
• 3.2.5 不同温度对D 的影响
• 3.2.6 负载L-Phe 有机相的反萃取
• 3.3 小结
• 第四章 游离重组大肠杆菌细胞生长特性
• 引言
• 4.1 游离细胞生长特性
• 4.2 萃取剂的生物相容性
• 4.3 SA-CMC/CaCl2 微胶囊的生物相容性
• 4.3.1 SA 的生物相容性
• 4.3.2 CMC 的生物相容性
• 4.3.3 CaCl2 的生物相容性
• 4.3.4 SA-CMC/CaCl2 微胶囊的生物相容性
• 4.4 NaCS-PDMDAAC 微胶囊的生物相容性
• 4.4.1 NaCS 的生物相容性
• 4.4.2 PDMDAAC 的生物相容性
• 4.4.3 NaCS-PDMDAAC 微胶囊生物相容性
• 4.5 本章小结
• 第五章 SA-CMC/CaCl2 微胶囊固定化重组大肠杆菌萃取发酵生产 L-Phe
• 引言
• 5.1 SA-CMC/CaCl2 微胶囊制备条件的确定
• 5.1.1 CMC 制备浓度的确定
• 5.1.2 SA 制备浓度的确定
• 5.1.3 CaCl2 浓度的确定
• 5.1.4 SA-CMC/CaCl2 微胶囊的机械性能
• 5.2 SA-CMC/CaCl2 微胶囊萃取发酵生产L-Phe
• 5.2.1 SA-CMC/CaCl2 微胶囊固定化细胞生长特性
• 5.2.2 SA-CMC/CaCl2 微胶囊固定化细胞萃取发酵特性
• 5.3 本章小结
• 第六章 NaCS-PDMDAAC 微胶囊固定化重组大肠杆菌萃取发酵生产 L-Phe
• 引言
• 6.1 NaCS-PDMDAAC 微胶囊制备条件的确定
• 6.1.1 NaCS 制备浓度的确定
• 6.1.2 PDMDAAC 制备浓度的确定
• 6.1.3 NaCS-PDMDAAC 微胶囊的机械性能
• 6.2 NaCS-PDMDAAC 微胶囊萃取发酵生产L-Phe
• 6.2.1 NaCS-PDMDAAC 微胶囊固定化细胞生长特性
• 6.2.2 NaCS-PDMDAAC 微胶囊固定化细胞萃取发酵特性
• 6.3 本章小结
• 第七章 结论与建议
• 7.1 结论
• 7.2 建议
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表论文
• 致谢