小花鬼针草抗前列腺增生活性成分的研究

论文摘要

前列腺增生是老年男性的多发病。在我国,随着人口年龄的增长,前列腺增生的发病率急剧上升,其预防与治疗成为老年医学领域的一项重要课题,从天然产物中发掘有效治疗药物日益引起了人们的关注。本课题组以体外抑制前列腺癌细胞（LNCaP cells）分泌前列腺特异性抗原（PSA）作为抗前列腺增生活性筛选体系,在对100多种中药提取物进行抗前列腺增生活性筛选过程中,发现小花鬼针草60%乙醇提取物具有较好的抑制LNCaP细胞分泌PSA活性。本文对小花鬼针草60%乙醇提取物进行了活性部位的确认,并采取反复硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、ODS柱色谱和制备高效液相等手段,对活性部位的化学成分进行了追踪分离。从小花鬼针草的活性部位即大孔吸附树脂柱30%和60%乙醇洗脱部分,共分离得到34个化合物,并通过理化性质和现代波谱学手段(UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR和2D-NMR)鉴定了33个化合物的结构,分别为苄基β-D-吡喃葡萄糖昔（1）;4-（2-羟基-2,6,6-三甲基环己-4-O-β-D-吡喃葡萄糖）-3-丁烯-2-酮（2）;3-（3,4-二羟基）苯基丙酸甲酯（3）;色原酮7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（4）;（1S,2S）-1-（3-甲氧基-4-羟基）苯基丙三醇（5）;（3R）8（E）-癸烯-4,6-二炔-1,3,10-三醇（6）;5-羟基色原酮7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（7）;8（E）-癸烯-4,6-二炔-3,10-二醇1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（8）;3,5-二甲氧基苯丙烯醇4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（9）;没食子酸（10）;原儿茶酸（11）;6-甲氧基香豆素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（12）;槲皮素（13）;木犀草素（14）;山奈酚（15）;2-羟基-3,4,4’,6’-四甲氧基查尔酮（16）;3,4,2’,4’,6’-五甲氧基二氢查尔酮（17）;3,4,2’,4’-四羟基查尔酮（18）;金合欢素7-O-（α-D-芹菜呋喃糖）（1→6）-β-D-吡喃葡萄糖苷（19）;硫磺菊素（20）;海生菊苷（21）;硫磺菊苷（22）;金丝桃苷（23）;木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（24）;山奈酚3-O-β-D-芸香糖苷（25）;芦丁（27）;槲皮苷（28）;山奈酚3-O-（α-L-阿拉伯呋喃糖）（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷（29）;3,4,2’-三羟基查尔酮4’-O-β-D-葡萄糖苷（30）;5,3’,4’-三羟基二氢黄酮7-O-β-D-葡萄糖苷（31）;木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷（32）;（2S,3S）二氢槲皮素（33）;二氢木犀草素（34）。34个化合物中,主要为黄酮类化合物,共22个,其中化合物6为新化合物,23个化合物为首次从该植物中分离得到。分离得到的34个化合物中,26个化合物显示了不同强度的抑制LNCaP细胞分泌PSA活性,活性化合物分为三种类型:黄酮类、苯丙素类和酚酸类。黄酮类化合物的活性强于苯丙素类和酚酸类,当测试浓度为15μM时,前者抑制分泌PSA的相对量在8.7%～55.4%,后两者抑制分泌PSA的相对量在9.0%～32.5%。在黄酮类化合物中,又以黄酮醇和黄酮的活性最好,查尔酮、二氢黄酮、橙酮的活性次之,黄酮苷类化合物的活性较弱。本文首次以体外细胞活性和总黄酮含量为评价指标,考察了小花鬼针草药材的最佳提取方法和工艺,结果表明提取物的活性强弱和总黄酮含量具有同比性,在水提醇沉、碱提酸沉、醇提水沉、醇提溶剂萃取和醇提大孔树脂分离的提取方法中,以60%乙醇提取大孔树脂分离的活性和总黄酮含量最高,洗脱部分活性富集作用好。而提取工艺则是以加20倍量60%乙醇提取三次,每次0.5 h的工艺最好,得到浸膏收率和总黄酮的含量最高。本文首次对小花鬼针草药材的质量控制进行了初步研究,对28批不同产地的小花鬼针草药材进行了高效液相指纹图谱研究,使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（中国药典2004A版）”和SPSS软件对这些样品进行了相似度分析和聚类分析,得到小花鬼针草的对照色谱图。也研究了用反相高效液相色谱同时测定小花鬼针草中四种成分的含量的方法,为小花鬼针草药材的质量控制提供了一定的理论依据。综上所述,本文在活性筛选的基础上对小花鬼针草药材抗前列腺增生活性成分进行了研究,并阐明了其主要活性物质为黄酮类、酚酸类和苯丙素类。又在活性测试的基础上考察了小花鬼针草提取方法和提取工艺,确定了小花鬼针草作为抗前列腺增生药物开发时的最佳提取方法和工艺。本文也进行了小花鬼针草指纹图谱和含量测定方法的研究工作,为小花鬼针草药材的开发利用提供了药材质量控制的理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语说明
• 第一章 前言
• 1.1 前列腺增生及其防治
• 1.2 BPH的发病机理
• 1.3 PSA与前列腺增生和前列腺癌
• 1.3.1 PSA是临床诊断前列腺增生和前列腺癌的最重要指标之一
• 1.3.2 抑制前列腺癌细胞分泌PSA作为抗前列腺增生活性的评价指标
• 1.4 立题依据
• 1.5 小花鬼针草的研究概况
• 1.5.1 概述
• 1.5.2 小花鬼针草的化学成分
• 1.5.3 小花鬼针草的药理作用
• 1.5.4 小花鬼针草的临床应用
• 第二章 小花鬼针草抗前列腺增生活性成分的研究
• 第一节 小花鬼针草抗前列腺增生活性部位/活性成分的追踪分离
• 2.1.1 小花鬼针草活性部位化学成分的分离
• 2.1.2 分离得到的化合物的名称、编号和结构
• 第二节 分离过程中活性部位的确定
• 2.2.1 实验部分
• 2.2.1.1 实验材料
• 2.2.1.2 实验方法
• 2.2.2 实验结果
• 2.2.2.1 大孔树脂柱色谱洗脱部位的活性筛选结果
• 2.2.2.2 60%乙醇洗脱部位经硅胶柱色谱后各个馏分的活性评价
• 2.2.2.3 30%乙醇洗脱部位经硅胶柱色谱后各个馏分的活性评价
• 第三节 化合物的结构鉴定
• 2.3.1 从30%乙醇洗脱部位分离得到的化合物的结构鉴定
• 2.3.2 从60%乙醇洗脱部位分离得到的化合物的结构鉴定
• 第三章 单体化合物抗前列腺增生活性评价
• 3.1 实验部分
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 实验结果
• 第四章 小花鬼针草提取方法和提取工艺研究
• 第一节 小花鬼针草作为抗前列腺增生药物提取方法的研究
• 4.1.1 提取方法的选择
• 4.1.2 实验操作
• 4.1.3 评价方法
• 4.1.3.1 采用不同提取方法及初步分离得到的14个馏分抑制PSA分泌活性评价
• 4.1.3.2 采用不同提取方法及初步分离得到的14个馏分中总黄酮的含量
• 4.1.4 小结
• 第二节 小花鬼针草作为抗前列腺增生药物提取工艺的研究
• 4.2.1 正交实验设计
• 4.2.2 浸膏收率的测定
• 4.2.3 浸膏中总黄酮含量的测定
• 4.2.4 验证实验
• 4.2.5 小结
• 第五章 小花鬼针草质量控制方法的研究
• 第一节 小花鬼针草药材醇提取物HPLC指纹图谱的建立
• 5.1.1 原料药材的采集
• 5.1.2 仪器与试药
• 5.1.3 样品溶液的制备方法考察
• 5.1.4 HPLC指纹图谱最佳条件摸索
• 5.1.4.1 色谱柱的选择
• 5.1.4.2 检测器及检测条件的选择
• 5.1.4.3 流动相及洗脱条件的选择
• 5.1.5 HPLC指纹图谱测试方法的综合考察
• 5.1.5.1 供试品溶液的制备
• 5.1.5.2 专属性试验
• 5.1.5.3 系统适应性试验
• 5.1.5.4 精密度、重现性和稳定性试验
• 5.1.6 小花鬼针草药材醇提取物HPLC指纹图谱的建立
• 5.1.6.1 指纹图谱液相色谱条件
• 5.1.6.2 指纹图谱质谱条件
• 5.1.6.3 HPLC指纹图谱中主要色谱峰的化学指认
• 5.1.6.4 小花鬼针草HPLC指纹图谱的建立
• 5.1.6.5 不同产地药材的指纹图谱聚类分析
• 5.1.6.6 不同产地药材指纹图谱的相似度比较
• 5.1.7 小结
• 第二节 小花鬼针草化学成分的含量测定
• 5.2.1 仪器与试药
• 5.2.2 小花鬼针草中的原儿茶酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷含量测定方法的建立
• 5.2.2.1 色谱条件的选择
• 5.2.2.2 溶液的制备
• 5.2.2.3 系统适用性实验
• 5.2.2.4 线性关系考察
• 5.2.2.5 精密度试验
• 5.2.2.6 重复性试验
• 5.2.2.7 样品稳定性试验
• 5.2.2.8 加样回收率试验
• 5.2.2.9 样品含量测定
• 5.2.3 小结
• 第六章 实验部分和化合物结构鉴定数据
• 6.1 实验用仪器
• 6.2 实验用材料
• 6.2.1 提取分离实验用材料
• 6.2.2 生物活性测试材料
• 6.3 化合物结构鉴定数据
• 第七章 结果与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录