论文摘要
背景与目的:DNA依赖蛋白激酶（DNA dependent protein kinase,DNA-PK）是DNA损伤感受器（sensors）之一,参与DNA双链断裂（DNA double strand breaks,DSBs）非同源末端连接（nonhomologous end-joining,NHEJ）的修复。DNA-PK由调节亚单位Ku（Ku70和Ku80）和催化亚单位（DNA-PK catalytic subunit,DNA-PKcs）组成。石英粉尘（简称石英）是我国最严重的职业危害因素之一,既可致矽肺,也可致癌。本课题组前期研究表明:石英刺激可致细胞周期S期阻滞;蛋白激酶B（serine/threonine kinase protein kinase B,PKB/Akt）通过激活丝裂素活化蛋白激酶（MAPKs）家族的ERK和JNK调控活化蛋白-1（activator protein-1,AP-1）的活性,对石英诱导的细胞周期蛋白D1（cyclin D1）的表达及细胞周期改变起调节作用。然而,石英所致DSBs修复感受器方面的研究尚未见报道。本研究拟以人胚肺成纤维细胞（human embryo lung fibroblasts,HELF）为实验模型,以DSBs及其修复为切入点,通过使用RNAi、显性失活突变体和化学抑制剂等研究手段,将我室以往的MAPKs通路研究向上溯源至DNA-PKcs,向下追踪到DSBs的修复,研究DNA-PKcs/JNK/p53通路在石英所致DSBs修复中的作用及DNA-PKcs/p53通路对石英诱导的细胞周期改变的影响,并探讨通路中信号分子的上下游关系。方法:1、采用脂质体转染法将DNA-PKcs的小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）质粒稳定转染HELF细胞,用免疫印迹（westernblot,WB）技术鉴定。2、采用中性彗星实验和/或γH2AX识别抗体技术检测DSBs的发生情况。并根据中性彗星的实验结果,计算DNA修复能力（DNA repair compentence,DRC）,DRC值越大,DSBs修复能力越强。3、采用WB技术测定蛋白表达及其磷酸化水平。免疫荧光技术检测γH2AX焦点在细胞内的定位及其水平。荧光素酶报告基因技术检测AP-1的活性。流式细胞术检测细胞周期。结果:1、成功建立稳定共转染的细胞系。2、200μg/ml石英致HELF细胞DSBs在12h达峰值,24h残留损伤减少,提示石英诱导的DSBs在24h内可被一定程度的修复。3、石英所致H2AX磷酸化是DNA-PKcs依赖性的,DNA-PKcs表达影响石英所致DSBs的识别。提示DNA-PK是石英所致DSBs感受器。4、DNA-PKcs、Akt、JNK、AP-1、p53在石英所致DSBs修复中的作用石英作用阴性转染对照细胞,DRC=59.67%;抑制DNA-PKcs表达后,DRC=22.47%,DSBs修复能力降低。石英作用空载体对照细胞,DRC=67.25%;抑制Akt表达后,DRC=26.13%,DSBs修复能力降低。抑制JNK表达后,在检测的24h点内,Olive尾矩呈现持续增高趋势,表明石英所致DSBs修复能力明显降低。石英作用对照细胞,DRC=77.20%;抑制AP-1活性后,DRC=21.08%,表明石英所致DSBs修复能力明显降低。石英作用p53 siRNA的阴性对照细胞,DRC=57.19%;抑制p53表达后,DRC=87.68%,石英所致的DSBs修复能力增强。以上结果提示:DNA-PKcs、Akt、JNK和AP-1促进石英所致DSBs的修复;p53抑制石英所致DSBs的修复。5、DNA-PKcs、p53在石英致细胞周期改变中作用石英处理可增加S期细胞百分比;显著诱导cyclin D1、E2F1、p21表达及pRb-Ser780水平的增加,且呈现明显的时间反应关系;pRb及CDK4表达无明显改变。分别沉默DNA-PKcs和p53表达后,石英诱导的S期细胞百分比均进一步增加;石英诱导的E2F1表达及pRb-Ser780水平进一步增加,石英诱导的p21表达受抑制,石英诱导的cyclin D1表达无明显改变。提示DNA-PKcs和p53参与调控石英诱导的细胞周期改变。6、DNA-PKcs、Akt、JNK、AP-1、p53在石英致DSBs修复通路研究中的上下游关系石英诱导Akt、JNK、p53和AP-1活性增强。抑制DNA-PKcs表达,可显著抑制石英诱导的Akt、JNK、p53磷酸化水平增加及AP-1转录活性的增强。分别抑制Akt、JNK、AP-1后,石英诱导的p53表达无明显改变。结论:1、DNA-PK是石英所致DSBs的感受器;2、DNA-PKcs/Akt/JNK/AP-1通路可促进石英所致DSBs的修复;而p53表达则抑制石英所致DSBs的修复;3、DNA-PKcs/p53通路通过活化p21,负性调控E2F1表达及pRb-Ser780水平参与调控石英所致的细胞周期改变。总之,本研究初步证明了DNA-PKcs/JNK/p53通路在石英所致DSBs修复中的作用,所得结果加深了对石英致病分子机制的理解。
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