重组大流行流感疫苗的构建及制备工艺研究

论文摘要

禽流感是由A型流感病毒引起的鸟类感染性疾病,其中高致病性H5N1禽流感病毒可以在动物和人类中相互感染,且病死率极高。疫苗是预防禽流感的最主要的方法,而传统的禽流感疫苗的生产方式难以满足疫情爆发时的需求。我们首次应用家蚕杆状病毒表面展示技术高效表达禽流感病毒HA基因。首先利用杆状病毒载体pFastBacHTb作为转座载体,将gp64-HA基因转座到杆状病毒基因组（Bacmid）上,构建Bacmid-gp64-HA。然后通过脂质体将Bacmid-gp64-HA转染家蚕BmN细胞得到重组病毒vBmgp64-HA。以扩增后的重组病毒感染家蚕细胞,收集发病细胞,Western blotting和PCR分析结合血凝试验表明,gp64-HA基因在家蚕细胞中成功表达。可大规模获得重组杆状病毒,每头蚕蛹产量最高可达1 mg,这为研究并优化疫苗的生产工艺,生产出质量稳定可控的禽流感疫苗提供了保障。我们最初采用低速离心、高速离心、超速离心、区带离心分离纯化带囊膜的病毒,半成品比活达到206 u/mg,活性成分回收率为6.8%,但是对其进行SDS-PAGE和Western-Blotting时并没有发现相应的目的条带,分析实验结果发现,蚕蛹高达30%的油脂严重影响了病毒的分离效果,并造成了血凝试验的假阳性。我们采用30%饱和度硫酸铵溶液沉淀杂蛋白,并用60%饱和度硫酸铵溶液沉积病毒粒子代替超速离心,两者结合有效地使目的产物和油脂相分离,其中60%饱和度硫酸铵溶液沉积病毒粒子一步活性回收率高达88.9%,而且在改进生产工艺后,样品在SDS-PAGE和Western-Blotting分析时也出现了明显的目的条带,该工艺生产的半成品血凝滴度可以达到1:28,但是其蛋白浓度也达到了103 mg/mL,过多的杂蛋白导致超滤缓慢,过滤除菌也因样品透不过0.22μm膜而失败;为去除过多的杂蛋白,新工艺加入了对低速离心得到的上清经过10μm、0.45μm滤芯抽滤,再用两次区带离心代替一次区带离心的方法,最后的半成品采用透析脱糖的方法代替超滤脱糖,其中两次区带离心对病毒的分离和浓缩起到了很好的效果,其比活从第一次区带离心的34 u/mg提高到100 u/mg,而且第二次区带离心后回收的半成品的血凝滴度达到了1:24,其蛋白浓度只有3.2 mg/mL,比活可以达到100 u/mg,改进后的工艺,纯化明显,批次制备的样品质量稳定,为禽流感疫苗的大批量生产提供了可靠的依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 禽流感疫苗研究进展
• 引言
• 1 禽流感病毒简介
• 2 流感疫苗的类型
• 2.1 全病毒疫苗
• 2.2 裂解疫苗
• 2.3 毒粒亚单位疫苗
• 3 禽流感疫苗研究进展
• 4 新型疫苗载体--昆虫杆状病毒载体
• 5 疫苗制备及检测技术介绍
• 5.1 区带离心
• 5.2 血凝试验
• 第二章 实验方案设计
• 1 研究目的和意义
• 2 研究内容
• 3 实验基本流程
• 3.1 重组杆状病毒的构建
• 3.2 禽流感疫苗制备工艺
• 第三章 重组病毒的构建
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 主要试剂配制
• 2 实验方法
• 2.1 细胞培养与冻存、复苏
• 2.2 重组转移载体pFastBacHTb-gp64-HA 的构建
• 2.3 重组Bacmid- gp64-HA 的构建
• 2.5 重组Bacmid 通过脂质体介导法感染家蚕BmN 细胞
• 2.6 重组病毒vBmgp64-HA PCR 鉴定
• 2.7 重组蛋白gp64-HA 在家蚕BmN 细胞中的表达和鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 重组转移载体pFastBacHTb-gp64-HA 的鉴定
• 3.2 重组Bacmid- gp64-HA 的 PCR 鉴定
• 3.3 重组病毒vBmgp64-HA 的PCR 鉴定
• 3.4 HA 蛋白在在家蚕细胞中的表达与鉴定
• 3.5 HA 蛋白在在家蚕细胞中的血凝活性鉴定
• 4 讨论
• 第四章 逐级离心生产工艺
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料的获得
• 1.2 试剂
• 1.3 主要溶液配制
• 1.4 实验设备
• 2 方法
• 2.1 实验前准备工作
• 2.2 匀浆
• 2.3 低速离心
• 2.4 高速离心
• 2.5 超速离心
• 2.6 区带离心
• 2.7 超滤除糖
• 2.8 样品活性检测
• 2.9 样品蛋白浓度测定
• 3 结果与分析
• 3.1 工艺各个步骤样品的血凝活性和蛋白浓度检测
• 4 讨论
• 第五章 硫酸铵分级盐析分离油脂和杂蛋白工艺初探
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料的获得
• 1.2 试剂
• 2 方法
• 2.1 硫酸铵分级沉淀条件的摸索
• 2.2 血凝试验
• 2.3 SDS-PAGE 检测
• 2.4 Western blotting 检测
• 3 结果与分析
• 3.1 样品血凝实验结果
• 3.2 SDS-PAGE 检测、Western blotting 检测结果
• 4 讨论
• 第六章 硫酸铵分级盐析分离油脂和杂蛋白工艺
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料的获得
• 1.2 试剂
• 1.3 主要溶液配制
• 1.4 实验设备
• 2
• 2.1 实验前准备工作
• 2.2 匀浆
• 2.3 低速离心
• 2.4 高速离心
• 2.5 硫酸铵分级沉淀蛋白
• 2.6 超滤除盐
• 2.7 区带离心
• 2.8 超滤脱糖
• 2.11 样品活性检测
• 2.12 样品蛋白浓度测定
• 2.13 SDS-PAGE 和Western blotting 检测
• 3 结果与分析
• 3.1 工艺各个步骤样品的血凝活性和蛋白浓度检测
• 4 讨论
• 第七章 膜抽滤、两次区带离心去除杂蛋白工艺初探
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料的获得
• 1.2 试剂
• 2 工艺摸索
• 2.1 抽滤处理
• 2.2 两次区带离心与一次区带离心比较
• 2.3 超滤脱糖与透析脱糖比较
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第八章 改进后的生产工艺
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料的获得
• 1.2 试剂
• 1.3 主要溶液配制
• 1.4 实验设备
• 2 方法
• 2.1 实验前准备工作
• 2.2 匀浆
• 2.3 低速离心
• 2.4 高速离心
• 2.5 硫酸铵分级沉淀蛋白
• 2.6 超滤除盐
• 2.7 第一次区带离心
• 2.8 第二次区带离心
• 2.9 透析除糖
• 2.10 样品活性检测
• 2.10.1 1%鸡红细胞悬液的制备
• 2.10.2 血凝试验
• 2.11 样品蛋白浓度测定
• 2.12 SDS-PAGE 和Western blotting 检测
• 3 结果与分析
• 3.1 工艺优化效果分析
• 3.2 工艺的稳定性实验分析
• 4 讨论
• 第九章 基于家蚕多角体蛋白融合的Bm SMG9 蛋白高效表达及快速纯化研究
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 生物信息学分析
• 2.2 重组载体的构建
• 2.3 重组蛋白的表达与纯化
• 2.4 酶切后纯化结果
• 2.5 TEV 酶酶切结果及鉴定
• 2.6 酶切后目的蛋白的回收
• 2.7 家蚕五龄幼虫各组织中BmSMG9 基因的荧光定量PCR 数据结果
• 3. 讨论
• 总结
• 参考文献
• 致谢