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加替沙星、呋喃西林在食品中残留的酶联免疫检测法的研究

2020-12-07阅读(426)

加替沙星、呋喃西林在食品中残留的酶联免疫检测法的研究

论文摘要

随着全球经济一体化和食品贸易国际化的进行,食品安全已经成为一个重要的公共卫生问题。近几年来,中国出口食品的药物残留问题不断发生,食品出口也因药物残留问题屡屡受阻,给中国造成了巨大的经济损失,严重损害了中国食品的质量形象。解决产品药物残留问题,提高中国产品卫生安全质量,已成当务之急。兽药残留不仅直接对人体产生急、慢性毒性作用,引起细菌耐药性的增加,还通过环境和食物链的作用间接对人体健康造成潜在危害。为了保障消费者的生命安全,越来越多的国家已建立了一些药物残留的检测方法。目前国内外采用的残留分析检测方法主要有理化检测法（包括HPLC、LC-MS、LC-MS/MS等仪器法）、微生物检测法、免疫检测法（包括ELISA、RIA、EIA、FIA、MAIA）等。理化检测法准确、稳定、可靠,可以作为标准方法,但仪器设备昂贵,样品前处理复杂,费时,费力,不易普及;微生物检测法往往会高出最高检测量（MRLs）,灵敏度不高。因此必须建立快速、灵敏、有效的检测方法。免疫检测法中的酶联免疫检测法（包括ELISA、MAIA等）克服了以上方法的缺点,是一种快速、灵敏、方便、易普及的检测方法,有着广阔的发展前景。本论文旨在建立加替沙星、呋喃西林酶联免疫检测法。本论文分别利用加替沙星与SEM衍生物（CPSEM）分子中的羧基通过EDC法成功的制备了加替沙星与呋喃西林的免疫原,并通过动物免疫获得了相应的高特异性抗体。在对加替沙星的残留检测研究中,本文分别利用了间接ELISA法、直接ELISA法与MAIA法。其中,利用间接法测得,加替沙星抗体的IC50是2.6 ppb,检测限为0.05 ppb,线性范围为0.1-50 ppb;该抗体有很高的特异性,仅对环丙沙星有较小的交叉反应（交叉反应率为3.0%）;加替沙星在牛奶中的添加回收率在80-106%之间,批内变异系数低于14.3%,批间变异系数低于19.6%。利用直接法测得,加替沙星抗体的IC50是0.45 ppb,检测限低于0.01 ppb,线性范围为0.1-10 ppb;加替沙星在牛奶中的添加回收率在90%以上,批内变异系数低于4.6%,批间变异系数低于5.9%。利用磁分离免疫法对加替沙星的抗体进行检测,加替沙星抗体的IC50是0.085 ppb,检测限低于0.001 ppb,线性范围为0.01-10 ppb;加替沙星在牛奶中的添加回收率在97%以上,变异系数低于22%;加替沙星在猪尿中的添加回收率在80%以上,变异系数低于16.5%。在对呋喃西林残留检测研究中,抗体对于呋喃西林的IC50是10.5 ppb。该抗体具有良好的特异性,与其它硝基呋喃类药物及其代谢物几乎没有交叉反应（小于0.001%）。其中在对呋喃西林的残留检测中,呋喃西林的检测线性范围为2.5-100 ppb;呋喃西林在水体系中的添加回收率在84-106%之间;批内变异系数低于5.6%,批间变异系数低于7.3%。通过本课题的研究,成功地制备了用于检测加替沙星与呋喃西林的高特异性的多克隆抗体。利用这些抗体,本研究建立了加替沙星、呋喃西林的快速灵敏的酶联免疫吸附检测法,为最终开发商品化的酶联免疫试剂盒打下了良好的基础;并建立了加替沙星磁分离免疫检测法,为磁分离免疫检测方法的广泛使用提供了进一步的依据。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 符号说明
  • 第一章 序言
  • 第一节 加替沙星、呋喃西林概述
  • 1.1.1 加替沙星概述
  • 1.1.2 呋喃西林概述
  • 第二节 加替沙星、呋喃西林残留检测方法
  • 1.2.1 喹诺酮类抗生素残留检测方法
  • 1.2.1.1 微生物法
  • 1.2.1.2 仪器法
  • 1.2.1.2.1 高效液相色谱法（HPLC）
  • 1.2.1.2.2（高效）液相-质谱联用法（（HP）LC-MS）
  • 1.2.1.2.3 其它仪器方法
  • 1.2.1.3 酶联免疫吸附法（ELISA）
  • 1.2.1.4 磁分离酶联免疫检测法（MAIA）
  • 1.2.2 硝基呋喃类药物及其代谢物残留检测方法
  • 1.2.2.1 液相色谱-质谱联用法（LC-MS）
  • 1.2.2.2（高效）液相色谱-串联质谱法（（HP）LC-MS/MS）
  • 1.2.2.3 酶联免疫法（ELISA）
  • 第三节 酶联免疫检测方法（ELISA）
  • 1.3.1 ELISA基本原理
  • 1.3.2 ELISA检测类型
  • 1.3.3 ELISA的特点
  • 1.3.4 加替沙星、呋喃西林酶联免疫检测的研究现状
  • 1.3.4.1 加替沙星酶联免疫检测的研究现状
  • 1.3.4.2 呋喃西林酶联免疫吸附检测的研究现状
  • 第四节 磁分离酶联免疫检测方法（MAIA）
  • 1.4.1 MAIA基本原理
  • 1.4.2 MAIA基本操作
  • 第五节 本研究内容、目的、意义
  • 第二章 加替沙星、呋喃西林免疫原及包被抗原的制备与鉴定
  • 第一节 实验材料与设备
  • 2.1.1 主要试剂
  • 2.1.2 主要仪器设备
  • 2.1.3 主要缓冲溶液的配制
  • 第二节 加替沙星、呋喃西林免疫原及包被抗原的制备
  • 2.2.1 活化牛血清白蛋白（cBSA）的制备
  • 2.2.2 加替沙星免疫原、包被抗原及加替沙星酶标记物的制备
  • 2.2.2.1 EDC法加替沙星免疫原（GAT-cBSA）的制备
  • 2.2.2.2 EDC法加替沙星包被抗原（GAT-OVA）的制备
  • 2.2.2.3 EDC法酶标记加替沙星（GAT-HRP）的制备
  • 2.2.3 呋喃西林免疫原及包被抗原的制备
  • 2.2.3.1 CPSEM与NPSEM的合成（图2-2）
  • 2.2.3.2 呋喃西林免疫原（CPSEM-cBSA）的制备
  • 2.2.3.3 呋喃西林包被抗原（SEM-OVA）的制备
  • 第三节 结果与讨论
  • 2.3.1 载体蛋白的选择
  • 2.3.2 免疫原的鉴定方法
  • 2.3.3 加替沙星免疫原及包被抗原的紫外吸收谱图（图3-1、图3-2）鉴定分析结果及讨论
  • 2.3.4 加替沙星酶标记物的紫外吸收谱图（图3-3）鉴定分析结果及讨论
  • 2.3.5 CPSEM、NPSEM结构的鉴定
  • 2.3.6 呋喃西林免疫原及包被抗原紫外谱图（图3-6、3-7）鉴定分析结果及讨论
  • 2.3.7 小结
  • 第三章 加替沙星、呋喃西林多克隆抗体制备与检测
  • 第一节 实验材料与设备
  • 3.1.1 主要试剂及材料
  • 3.1.2 主要仪器及设备
  • 3.1.3 主要缓冲溶液的配制
  • 第二节 加替沙星、呋喃西林多克隆抗体的制备
  • 3.2.1 免疫方案
  • 3.2.2 心脏采血
  • 3.2.3 抗体的纯化及保存
  • 3.2.3.1 饱和硫酸铵纯化抗体及保存
  • 3.2.3.2 蛋白A亲和层析法纯化抗体及保存
  • 第三节 加替沙星、呋喃西林多克隆抗体的ELISA检测
  • 3.3.1 加替沙星多克隆抗体的ELISA评价
  • 3.3.1.1 间接法加替沙星抗体亲和度（效价）、灵敏度、特异性的测定
  • 3.3.1.1.1 间接法加替沙星抗体效价的测定
  • 3.3.1.1.2 间接法抗体与包被抗原的优选（方阵）
  • 3.3.1.1.3 间接法加替沙星抗体灵敏度的测定
  • 3.3.1.1.4 间接法加替沙星抗体特异性（交叉率）的测定
  • 3.3.1.2 直接法加替沙星酶标记物的鉴定
  • 3.3.1.2.1 羊抗兔IgG与抗体浓度的确定
  • 3.3.1.2.2 酶标记抗原（GAT-HRP）与抗体浓度的确定
  • 3.3.1.2.3 直接法加替沙星抗体灵敏度的测定
  • 3.3.2 加替沙星多克隆抗体的MAIA评价
  • 3.3.2.1 磁珠用量与抗体浓度的确定
  • 3.3.2.2 免疫磁珠灵敏度的测定
  • 3.3.3 呋喃西林多克隆抗体的ELISA评价
  • 3.3.4 结果与分析
  • 3.3.4.1 加替沙星抗体的检测结果与分析
  • 3.3.4.1.1 间接法加替沙星抗体的效价测定
  • 3.3.4.1.2 间接法加替沙星抗体灵敏度的测定
  • 3.3.4.1.3 间接法加替沙星抗体特异性（交叉率）的测定
  • 3.3.4.1.4 直接法加替沙星抗体的灵敏度的测定
  • 3.3.4.1.5 MAIA法加替沙星抗体的灵敏度的测定
  • 3.3.4.2 呋喃西林抗体的检测结果与分析
  • 3.3.4.2.1 呋喃西林抗体的效价测定
  • 3.3.4.2.2 呋喃西林抗体灵敏度的测定
  • 3.3.4.2.3 呋喃西林抗体特异性的测定
  • 第四章 加替沙星、呋喃西林回收率的测定
  • 第一节 实验材料和设备
  • 4.1.1 主要试剂和设备
  • 第二节 加替沙星、呋喃西林回收率的测定
  • 4.2.1 加替沙星回收率测定
  • 4.2.1.1 间接法加替沙星回收率测定
  • 4.2.1.1.1 标准曲线的建立
  • 4.2.1.1.2 生物基质的影响
  • 4.2.1.1.3 回收率和变异系数的测定
  • 4.2.1.1.4 结果与讨论
  • 4.2.1.2 直接法加替沙星回收率测定
  • 4.2.1.2.1 标准曲线的建立
  • 4.2.1.2.2 生物基质的影响
  • 4.2.1.2.3 回收率和变异系数的测定
  • 4.2.1.2.4 结果与讨论
  • 4.2.1.3 MAIA法加替沙星回收率测定
  • 4.2.1.3.1 标准曲线的建立
  • 4.2.1.3.2 牛奶体系中加替沙星回收率测定
  • 4.2.1.3.2.1 基质影响的测定
  • 4.2.1.3.2.2 回收率和变异系数的测定
  • 4.2.1.3.3 猪尿体系中加替沙星回收率测定
  • 4.2.1.3.3.1 回收率及变异系数的测定
  • 4.2.1.3.4 结果与讨论
  • 4.2.2 呋喃西林回收率测定
  • 4.2.2.1 标准曲线的建立
  • 4.2.2.2 回收率和变异系数的测定
  • 4.2.2.3 结果与讨论
  • 4.2.4 本章小结
  • 第五章 结论
  • 附图
  • 参考文献
  • 本人发表的文章和专利
  • 致谢
  • 学位论文评阅及答辩情况表

    • 相关论文文献

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