论文摘要
目的研究重组腺病毒介导的野生型p53基因转染左向右分流型先心病肺动脉高压大鼠,观察转染后目的基因的表达情况,及其对肺动脉高压的抑制作用和对肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。方法将pCMVp53重组转移载体经BamH1和NheI酶切,得到p53基因cDNA,然后将cDNA片段克隆到转移载体pCMV5GFP,使其受CMV5启动子的调控,获得pCMV5p53重组转移载体,用该线状重组转移载体与腺病毒右臂DNA经磷酸钙共转染293细胞获得重组腺病毒,经酶联免疫吸附法（ELISA）测定p53蛋白含量,证明外源p53基因在含重组腺病毒的293细胞中得到表达。同法创建对照组病毒Adeno-lacZ。48只大鼠随机分为4组:Ⅰ组（n=10）为空白对照组,仅做假手术处理;Ⅱ组（n=13）为模型对照组,通过套管法建立左向右分流型PH模型;Ⅲ组（n=14）为实验组,建立PH模型,并通过气管吸入法转染Adeno-p53重组腺病毒;Ⅳ组（n=11）为实验对照组,建立PH模型,并通过气管吸入法转染Adeno-lacZ重组腺病毒。16周后右心导管法测量各组大鼠右室平均压（mRVP）和肺动脉平均压（mPAP）,计算右心室肥厚指数（RVHI）及RV/BW,评估野生型p53基因对模型大鼠血流动力学的影响,HE染色观察小动脉结构、测量小动脉管径及管壁厚度计算WT%,Ⅲ、Ⅳ组Western blot法鉴定p53基因产物在肺组织中的表达。采用免疫组织化学方法研究肺动脉平滑肌细胞PCNA的表达,并通过原位缺口末端标记方法（TUNEL）检测大鼠肺动脉平滑肌细胞的凋亡,分别计算增殖指数（PI）、凋亡指数（AI）及PI/AI。结果1.Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组的mRVP、mPAP及WT%均明显高于Ⅰ组（P＜0.05）,Ⅱ、Ⅳ组RVHI明显高于Ⅰ组（P＜0.05）;与Ⅱ组相比,Ⅲ组的mPAP、mPVP、RVHI及WT%明显降低（P＜0.05）,但与Ⅰ组相比,Ⅲ组的mPAP、mPVP及WT%仍明显高于Ⅰ组（P＜0.05）;与Ⅳ组相比,Ⅲ组的各项指标均低于Ⅳ组（P＜0.05）。HE染色标本上可见,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组肺动脉肌层及内膜均有不同程度的增厚以及肺小动脉肌化管腔狭窄;而Ⅰ组血管内膜光滑,内皮细胞连续,管壁薄,厚度均匀一致。2.Western blot结果示Ⅲ组出现特异性条带,提示目的基因已成功表达功能蛋白。3.转染野生型p53基因的Ⅲ组,PI明显低于Ⅱ组与Ⅳ组（P＜0.05）,AI明显增高,高于其他三组（P＜0.05）,PI/AI明显低于Ⅱ组与Ⅳ组（P＜0.05）。结论1.腺病毒携带野生型p53基因通过气管吸入法转染入左向右分流肺动脉高压大鼠模型体内并呈高表达。2.本实验野生型p53基因可在一定程度上抑制大鼠左向右分流型肺动脉高压的发展,其机制可能在于野生型p53基因可以诱导肺动脉平滑肌细胞凋亡的增加。
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