论文摘要
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）重组菌株HD73（pHC39）能同时产生双金字塔形和立方体形伴孢晶体，其晶体蛋白分别仅由cry1Ac和cry2Aa基因编码形成。本研究对双金字塔形和立方体形伴孢晶体进行选择性溶解和层析，使两种晶体蛋白-20 kb DNA复合物成分得到有效纯化，并分别抽提了其中的20-kb DNA片段混合体（20-kb DNA fragments，20-kb DNAs）。在此基础上，利用已报道的仅定位于苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种（Bt subsp. kurstaki）HD73染色体和75 kb内源大质粒上的相关基因作为遗传标记，利用PCR检测手段对同一亲本菌株中与双金字塔形和立方体形伴孢晶体复合存在的两种20-kb DNA的来源进行了分析。1．苏云金芽孢杆菌重组菌株HD73（pHC39）的构建以Bt 4.0718菌株双金字塔形伴孢晶体中20-kb DNA为模板，在获得cry2Aa基因编码区约1.9 kb序列的基础上，采用cry2Aa基因的特异性引物对cry2Aa基因的全长序列进行PCR扩增，并将所得到的片段用合适的限制性内切酶酶切后连入与之具有互补粘末端E. coli-B. thuringiensis穿梭载体pHT304中，获得重组质粒pHC39。pHC39经电转化入Bt库斯塔克亚种（Bt subsp. kurstaki）HD73菌株中构建重组菌株HD73（pHC39）。cry2Aa基因在HD73（pHC39）中得到高效表达，产生典型立方体型伴孢晶体，Cry2Aa蛋白表达量占总蛋白量的64.2％。2．重组菌株HD73（pHC39）晶体的选择性溶解及层析纯化对HD73（pHC39）菌株产生的两种形态的伴孢晶体分别在不同的条件下进行选择性溶解，发现Cry1Ac和Cry2Aa晶体蛋白均与20-kb DNA相结合。将溶解的双金字塔形晶体复合物于NaCO3／HCl（pH9.5）缓冲体系，0-1 mol递增的Cl-梯度洗脱条件下进行离子交换层析，立方体形晶体复合物于NaCO3／NaOH（pH11.5）缓冲体系进行分子筛层析，得到相对纯化的晶体蛋白复合物，并从中分别抽提出与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白结合的20-kb DNA。3．对HD73（pHC39）中与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白相结合的20-kb DNA的来源分析采用定位于Bt库斯塔克亚种（Bt subsp. kurstagi）染色体基因组的16s rRNA的编码基因RRA和定位于HD73菌株内源75 kb大质粒的cry1Ac基因为遗传标记，以两种不同形态伴孢晶体中20-kb DNA为研究对象，以PCR检测技术为研究手段对其来源进行探索。结果在两种20-kb DNA上均检测到RRA基因和cry1Ac基因的存在，确定20-kb DNA来源于亲本菌株内源大质粒和染色体，且两种20-kb DNA在目前的研究范围尚未出现差异。4．20-kb DNA上染色体基因的鉴定采用相关数据库中已公布的苏云金芽孢杆菌5.2 Mb染色体DNA序列信息，每隔大致相同的距离选择一对基因并设计其特异引物，以这些基因为考量手段，探究染色体基因参入20-kb DNA是否存在区段特性，并为其成功克隆后阳性克隆的筛选提供选择标记。